英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下shRNA转染步骤（24孔板） 1.提前1天细胞种植 贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那 …
阅读更多 »慢病毒感染后多长时间换液和多长时间检测?
在慢病毒感染的实验中，通常的做法是，在感染后24小时更换培养液，目的是去除未吸附的病毒和残留的病毒介质，避免对细胞的毒性影响。更换培养液后，细胞会继续培养，通常会保持培养在常规的全培液中。 对于延长观察时间的问题，感染后72小时一般是观察慢病毒感染效果的一个标准时间点，因为大多数慢病毒的转导效率在72小时内达到峰值。尽管感染后24小时更换培养液，但并不意味着 …
阅读更多 »细胞的聚集体培养
聚集体培养(aggregate culture) 是指先将肿瘤细胞在旋转摇动培养仪上培养，使肿瘤细胞形成规则的细胞球体结构，然后再将球体进行静止培养，肿瘤细胞可自由从球体向周围移动，观察测量肿瘤细胞向周围移动的情况，记录移出细胞数、细胞移出最远距离等，也可计算肿瘤细胞运动的速度，比较不同肿瘤细胞运动性的差别。 （一）材料与设备 50ml 锥形瓶、旋转摇动培养 …
阅读更多 »SARDH调控T细胞代谢与癌症治疗（IF21.8）
文献标题：SARDH in the 1-C metabolism sculpts the T-cell fate and serves as a potential cancer therapeutic target 期刊：Cellular & Molecular Immunology 影响因子：21.8 概要：本研究通过泛癌单细胞转录组分析，发现线 …
阅读更多 »做好RNA转染的几点建议
1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …
阅读更多 »细胞转染为什么不能加血清？
看过很多细胞转染的高手，在做真核细胞转染时，都是在把核酸和转染试剂的混合液加入细胞表面以前，将融合的细胞的含血清的培养液弃去，用无血清培养基清晰后再加入混合物，4-6h后再换含血清的培养基。这是为什么呢？为什么这些转染试剂要求不含血清呢？ 传统的转染试剂有一定的细胞毒性，在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养基中添加抗生素。如，阳离子脂质体。带正电的脂 …
阅读更多 »细胞RNA转染实验注意事项
1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …
阅读更多 »培养基中pH 的调节
大多数细胞系增殖的最适pH 为7. 4, 当培养液逐渐变酸或变碱时，细胞的活力和增殖率将呈下降趋势。培养液必须缓冲细胞代谢葡萄糖和谷氨酰胺所产生的CO2 及乳酸。人们曾一度用碳酸氢盐、HCO3–与空气中CO2 共同构成一个缓冲体系，碳酸氢盐的低pka(pka=6. 1) 在pH7. 4 左右产生微弱的缓冲效能。无毒缓冲剂，如PIPES(pka=6 …
阅读更多 »影响RNA转染实验的因素有哪些？
1. 转染试剂 转染中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的，而且也尽量避免和质粒DNA转染混用——即使试剂本身兼容DNA和RNA转染，因RNA与DNA大小不同，转染条件不同，所需的试剂也应不同，所以RNA专用的转染试剂会更好一些。比如Entranster-R4000. 2. RNA转染时RNA的用量 RNA转染的用量必须参考RNA转染试 …
阅读更多 »电转染实验时，DNA有什么要求？
使用Entranster-E电转染试剂进行电转染实验时，应使用高纯度、无菌和无污染的DNA进行电穿孔实验。质粒DNA要求无内毒素，OD值为1.8-2.0。不建议使用微型试剂盒制备DNA，因为它可能含有高水平的内毒素。 不要使用仅用乙醇沉淀法纯化的DNA …
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