细胞生物学

1.细胞密度 　　一般来说，当细胞密度达到60%～80%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。 2.细胞状态 　　这点非常关键，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。 　　还有，尽量选择无 …

1．选择合适的转染试剂       不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。如英格恩的 …

既然目标蛋白的半衰期是30小时，说明它在细胞中相对稳定，也就是说，蛋白不会很快降解。 在使用siRNA干扰该蛋白的表达时，有几个关键时间点需要考虑： 一般siRNA作用流程： 转染后6–12小时：siRNA开始被细胞利用，mRNA水平开始下降。 24–48小时：mRNA水平通常显著降低（具体情况因靶基因和细胞类型而异）。 48–72小时：蛋白水平逐步下降，尤 …

大多数实验室购买的培养基是预先处理好的瓶装液体培养基，或者是干粉状的需要水化和过滤除菌的培养基，后者比较便宜，用量大时更有价值。 由于培养基中都有酚红或其他染料pH 指示剂，虽然外观看上去都差不多，但事实上它们并不一样，所以千万不能用错。 添加有酚红pH指示剂的培养基的颜色 pH6.5 以下为拧檬黄 pH6.5 为黄色 pH7.0 为橙色 pH7.4 为红色 …

目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒。关于慢病毒和腺病毒的原理以及特别前面的文章中都有介绍过，可以搜索关键字查看。今天主要介绍病毒感染细胞的实验流程。 1.构建目的基因到载体 构建手段 一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。 1）如果原始 …

根据病毒的TCID50值计算给毒的MOI（Multiplicity of Infection，感染倍数）通常需要几个步骤。MOI 是指每个宿主细胞上平均感染的病毒颗粒数。 步骤概述： 知道病毒的TCID50值：TCID50 是一种病毒活性的度量，表示每单位体积（通常为每毫升）病毒悬液中，能在 50% 的细胞文化中引起感染的病毒数量。单位通常是病毒颗粒数/毫升 …

关于使用嘌呤霉素筛选标记（puromycin resistance marker）的慢病毒（lentivirus）或逆转录病毒（retrovirus）进行病毒滴定（virus titration）的 protocol，确实有不少不同的做法，这是因为不同实验室根据自己的系统和需求进行了优化。但是，有一些权威且广泛应用的标准流程可以作为通用参考，下面是整理的一个 …

答：你描述的策略（铺板加药做qPCR，转染后加药做WB）是合理的，并且遵循了两种检测方法对时间需求的不同逻辑：qPCR关注转录早期/中期，WB关注蛋白积累的中/后期。 这不是唯一方案： qPCR： 有时也可以在转染后某个时间点（如6-12小时）加药，再培养足够时间（如再培养18-36小时）后收样，总处理时间也可能达到24-48小时。这取决于药物起效速度和你想 …

  1.DEAE-葡聚糖。这是早在1965年出现的转染方法。带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子，使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克，也可能是细胞内吞作用使得DNA复合体进入细胞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染，可重复性好，转染时要除掉血清。 2.磷酸钙共沉淀转染。最早在197 …

1.RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细胞数量较少时转 …