英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1. 电穿孔法。通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。DN被认为是穿过孔扩散到细胞内的。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪。此法每次转染需要更多的细胞和DNA，因为细胞的死亡率 …
阅读更多 »DNA转染试剂对比
由此可见，Entranster-H4000具有更好的转染效果。
阅读更多 »磷酸钙转染法实验原理及步骤
【实 验 原 理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。 【仪器、材料和试 …
阅读更多 »慢病毒感染后72小时，效率低，细胞已经长满，有什么办法补救？
在慢病毒感染后72小时感染效率较低、细胞已经长满的情况下，可以尝试以下几个措施来提高感染效率并优化实验条件： 细胞传代或重新播种：如果细胞已经长满（汇合度较高），可能会影响慢病毒的感染效率。可以将细胞进行传代，重新播种在新的培养板上，使其达到较低的汇合度（例如30-50%），然后再进行感染。 优化感染时的MOI（Multiplicity of Infecti …
阅读更多 »电转染时，指数衰减脉冲形式的电转条件是什么？
对于engreen的Entranster-E电转染试剂，当使用0.4cm比色杯时，大多数细胞类型的指数衰减脉冲条件在200-300V的电压范围和800-1000μF的电容范围内。对于0.2 cm比色杯时，其范围分别为80-160 V和800-1000μF。对于使用0.4 cm比色杯的电穿孔实验，测试电压范围 …
阅读更多 »细胞转染实验的建议
1.如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×10^6-4×10^6细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。 2.用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。 3.培养基中的血清 …
阅读更多 »siRNA转染效率不理想的原因
siRNA转染效率不理想，常见的原因有： 1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率 …
阅读更多 »siRNA转染后目标基因不降反升的原因
一、生物学与分子机制相关原因 1️⃣ 负反馈调控 (feedback regulation) 某些基因被抑制后，会触发细胞的代偿机制。 例如，目标基因下调后，上游转录因子或信号通路被激活，从而 反向上调目标基因 的转录。 特别常见于信号通路核心分子（如 MAPK、PI3K、NF-κB、p53 等）的 knockdown 实验。 建 …
阅读更多 »电转染实验时，siRNA有什么要求？
使用高纯度、无菌的siRNA。确定电转染的最佳siRNA浓度。建议在250-750nM最终浓度范围内的进行siRNA不同浓度的梯度实验。建议设置一个非靶向或无意义的siRNA对照序列，以验证实验siRNA的特异性。同时也验证，针对单个基因用多个siRNA序列实验产生的表型是否是由于脱靶 …
阅读更多 »已经把miRNA转染到了SW480细胞中，用来抑制RUNX1的表达，从而抑制细胞行为。已经通过WB验证了转染三天后RUNX1受到了抑制。现在的问题是应该在转染三天后消化细胞再做划痕实验，还是先种板做划痕再进行转染。
我的建议： 通常来说，如果你想研究miRNA对划痕愈合（细胞迁移）的影响，建议先进行miRNA转染，等待足够的时间让miRNA发挥作用（你提到的是三天），然后再进行划痕实验。这可以确保在进行划痕实验时，RUNX1已经被下调，迁移实验所观察到的结果是由RUNX1抑制所导致的。 但如果你担心转染后细胞的粘附性不好或者转染效率不高，也可以先进行划痕实验，让细胞在板 …
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