蛋白和酶

荧光淬灭是Western Blot发光时常见的现象，即加ECL发光液后立刻可以看到很明显的亮光，但亮光很快就消逝了，压完片后条带却很弱，甚至没有条带，发生这种情况的原因可能有以下几个方面: 1. 抗体浓度太高，局部过多的HRP会快速消耗底物，导致荧光信号过强，条带呈灼烧样。可降低抗体上样量。 2. 抗体浓度太低，荧光信号太弱，可能第一次压片能够获得很弱的条带 …

将收集的各样品加入等体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm离心10min，取上清-20℃保存备用。 SDS-PAGE蛋白质电泳 1）按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。 2）分离胶的制备 按下列成分配制10mL 12%分离胶： ddH2O 30%丙烯酰胺混合液 1.5M Tris …

一种按适当配方制造的冻干蛋白质制剂能够在几年内保持稳定，即使是在室温(Carpenter and Chang 1996) ；然而，冻干配方的最佳溶液组成和工艺条件的研制远远超出了典型学术实验室的能力范围。一个主要的困难是大多数实验室中所用的冻干机通常没有控制样品温度的能力，不能达到低水平的残留水（如低于质量的1%~2%），而低水平的残留水是冻干产品长期保存活 …

限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA 序列之内或其附近的特异位点上，井在此切割双链DNA 。它可分3 类，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。 I 类和Ⅲ类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰（甲基化）作用及依赖于ATP 的限制（切割）活性。Ⅲ类限制酶在识别位点上切割DNA ，然后从底物上解离。 …

常见问题 解决对策   两块玻璃板之间灌胶，胶总是不平 玻璃没有洗干净，应该洗得很干净 过硫酸铵和TEMED加量相对较多 加完试剂后应摇匀            总是漏胶 避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损 将两块玻璃板摆放对齐，底部处于同一平面 膜上有明显气泡 操作时将气泡完全排除 靠膜一侧的滤纸应铺平   特异性低 优化一抗 提高一抗和 …

经常有人做Western-Blot会疑惑：为什么做蛋白实验，应该把杂蛋白去除才对，会担心其他蛋白的加入会影响实验结果，增加背景。但为什么偏偏会用加入BSA，脱脂蛋白的方法减少背景呢？ 这需要从Western-Blot的原理说起，Western-Blot中电泳转膜后让蛋白分布NC膜或PVDF膜上，但膜上还有很多地方是空白的，这些空白的地方如果不被封闭，很可能就 …

出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。 4. …

当细胞被裂解，内容物释放时，蛋白水解酶和其他一些降解的酶也一同被释放，这时候需要在裂解的缓冲液中加入蛋白水解酶。PS: 细胞自己的蛋白水解酶也会降解细胞内的蛋白质。 抑制剂 靶向的蛋白酶 有效浓度 储存浓度 其他 抑蛋白酶肽 丝氨酸蛋白水解酶 0.1-2ug/ml 10mg/ml溶解在PBS中 避免反复冻融 EDTA 金属蛋白水解酶 0.5-2mmol/L …

既然目标蛋白的半衰期是30小时，说明它在细胞中相对稳定，也就是说，蛋白不会很快降解。 在使用siRNA干扰该蛋白的表达时，有几个关键时间点需要考虑： 一般siRNA作用流程： 转染后6–12小时：siRNA开始被细胞利用，mRNA水平开始下降。 24–48小时：mRNA水平通常显著降低（具体情况因靶基因和细胞类型而异）。 48–72小时：蛋白水平逐步下降，尤 …

当分离蛋白质时，包含有蛋白质的细胞和细菌须先被裂解。物理法裂解。利用各种机器来完成，例如：1. 氮气气穴弹。氮气解压是裂解真核细胞的一种温和方法，存在于一定压力下的氮气与细胞内的氮气达到平衡。释放压力时，溶液中产生的氮气和间歇的气泡导致单个细胞膜的破裂，但不再有进一步的细胞裂解发生，细胞器还是保持完整，而且氮气产生的压力和气温降低都会保护蛋白质不被降解。2. …