英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …
阅读更多 »siRNA转染后细胞死亡的原因是什么？
siRNA转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；可以选择细胞毒性小的非脂质体类的转染试剂，如Entranster试剂，另外，如果siRNA所靶向的基因对于维持细胞生长是非常重要的，出现细胞死亡的 …
阅读更多 »如何提高病毒感染细胞实验效率？
可使用病毒感染增强剂envirus提高病毒的感染效率，下面以慢病毒为例，说一下实验过程。 1.提前一天细胞铺板 提前一天将细胞种植在24孔板中，以感染时细胞融合度在50%左右为宜(悬浮细胞根据需要调整，不要采用过高的细胞密度)。 2.感染 ⑴将2ul的Envirus-LV用25μl无血清稀释液稀释，充分混匀，制成Envirus-LV稀释液。4℃静置5分钟。 …
阅读更多 »siRNA细胞转染效率低的原因是什么？
1. siRNA与转染试剂比例不佳 由于siRNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了siRNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细 …
阅读更多 »为什么脂质体细胞转染试剂毒性大？
已有众多的文献报道，脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调。如参与PKC（蛋白激酶C）通路调节(Biochemistry.1992 Sep 22;31(37): 9025-30)；如抑制ATP酶的活性(Biochim Biophys Acta.2008 Apr;1777(4):362-8)； …
阅读更多 »RNA细胞转染实验注意事项
进行RNA细胞转染实验时，应注意以下几点： 1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中R …
阅读更多 »如何做好细胞转染实验？
1．选择合适的转染试剂 不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。如Entranster试剂。 2．保持最佳的细胞状态 一般低的 …
阅读更多 »DNA转染效率低的可能的原因有哪些？
1.准备不足 做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。 2.细胞污染 细胞污染也是造成细胞死亡，转染效率低下的一大原因。首先，转染细胞用的质粒必须保证无菌。而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。分享一个小秘诀：将提完质粒后或者提的最后一步 …
阅读更多 »细胞转染实验方法有哪些？
1. 脂质体法。中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。脂质体法始于1987年，此法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。阳离子脂质 …
阅读更多 »RNA转染实验效率低是什么原因？
RNA转染效率低，可能的原因： 1. 转染试剂不适合。建议选择RNA专用转染试剂，如Entranster。 2. 转染试剂和RNA的量不够，或者比例不对。优化实验条件，调整试剂和RNA用量，优化二者比例。 3.检测时间有问题。适当调整检测时间。 4. RNA质量问题。选择纯度高的RNA。 5. 细胞状态不佳。调整细胞状态，调整细胞融合度。
阅读更多 »