树鼩CRISPR筛选发现RNF6促进寨卡病毒跨越血脑屏障

标题: Tree Shrew Genome-Wide CRISPR Screen Identifies RNF6 as a Proviral Host Factor for Zika Virus Replication in Brain Microvascular Endothelial Cells （树鼩全基因组CRISPR筛选鉴定出RNF6是寨卡病毒在脑微血管内皮细胞中复制的病毒前体宿主因子）

期刊: Viruses (MDPI), 2026年3月发表

文献概要

本研究建立了首个树鼩（Tupaia belangeri）全基因组CRISPR/Cas9敲除（GeCKO）筛选平台，在脑微血管内皮细胞（BMECs）中系统鉴定寨卡病毒（ZIKV）感染的宿主因子。

采用英格恩（Engreen）产品的实验部分

1. siRNA介导的基因敲低实验（第4页，2.4节）

项目	内容
产品	Engreen转染试剂（北京英格恩生物科技有限公司）
货号	4000-3
实验目的	验证候选基因（RNF6、DNAL1、AGK、RECK、CCN6）的敲低效果
实验方法	将特异性siRNA或阴性对照siRNA（si-NC）转染至BMECs，敲低内源性候选基因

实验细节：

• 使用至少两个数据库（Ensembl、NCBI、Tree Shrew Database）的同源转录序列设计siRNA
• 所有siRNA由GenePharma（上海）设计合成
• 通过转染试剂将siRNA导入BMECs细胞

2. RNF6基因敲除实验（第4页，2.6节）

项目	内容
产品	Engreen转染试剂
货号	4000-05
实验目的	建立稳定的RNF6基因敲除（RNF6-KO）细胞系
实验方法	CRISPR/Cas9介导的RNF6基因敲除

实验细节：

• 使用来自sgRNA文库的特异性sgRNA（5′-CAAAGCGAGGGGCAGCGATT-3′）
• 将0.4 μg RNF6-KO质粒转染至树鼩BMECs
• 通过有限稀释法分离单克隆RNF6-KO细胞
• Western blotting确认敲除效率最高的克隆

实验意义

1. 技术验证意义

• GeCKO筛选平台的可靠性验证：通过siRNA敲低和CRISPR敲除的双重验证，确认了全基因组筛选结果的准确性
• RNF6的前病毒作用确证： loss-of-function（敲低/敲除）和gain-of-function（过表达/回补）实验形成了完整的证据链

2. 科学发现意义

• 首次发现RNF6在病毒感染中的功能：此前RNF6主要研究集中于肿瘤学领域，本研究首次揭示其作为ZIKV前病毒因子
• 机制探索基础：为后续RNF6-NS5相互作用、I型干扰素通路调控等机制研究奠定基础

3. 转化医学意义

• 宿主靶向抗病毒药物（HTA）靶点：RNF6作为保守的宿主因子，为开发广谱抗ZIKV药物提供新靶点
• 人源化研究基础：分子对接显示人源和树鼩RNF6共享NS5结合位点（Gln-59, Arg-140），支持向人类细胞模型转化的可行性

4. 方法学意义

• 树鼩模型应用拓展：证明树鼩作为非人灵长类动物模型的有效性，为其他病毒感染研究提供范式
• CRISPR筛选策略优化：正选择策略（positive selection）有效鉴定依赖性宿主因子

总结

英格恩转染试剂在本研究中成功应用于siRNA介导的基因敲低和CRISPR/Cas9质粒转导两个关键环节，为验证RNF6作为ZIKV前病毒宿主因子提供了可靠的实验技术支持。该研究不仅建立了首个树鼩全基因组CRISPR筛选平台，更重要的是发现了RNF6这一新型宿主因子，为理解ZIKV跨越血脑屏障的分子机制和开发宿主靶向抗病毒策略提供了重要理论依据。