siRNA转染很有效（蛋白水平明显降低），将siRNA序列构建进慢病毒（shRNA形式）后感染细胞，荧光表达很强，但目标蛋白并未敲低，这是什么原因

你遇到的这个问题在慢病毒（lentivirus）介导的RNA干扰实验中其实挺常见，下面我们逐步分析下可能的原因：

实验现象简述：

siRNA转染敲得很有效（蛋白水平明显降低）；

**将siRNA序列构建进慢病毒（shRNA形式）**后感染细胞；

荧光表达很强（说明病毒成功进入细胞，且有表达）；

但目标蛋白并未敲低，几乎没有 knockdown 效果。

可能原因分析：

1. shRNA构建方式不当

siRNA 和 shRNA 是两种形式：

siRNA 是合成的双链RNA，直接进入细胞起效；

shRNA 则是通过慢病毒表达的，需在细胞中转录后由细胞加工成 siRNA。

问题点：

你用的是 siRNA 序列，但未必能直接用于 shRNA 构建。

shRNA 的设计需要考虑发夹结构、loop 序列、sense/antisense 链的方向等。

如果构建方式错了，即使表达了也不能被Dicer正确处理成有效siRNA。

建议：

检查你用的shRNA表达载体是否正规设计（如 pLKO.1、pGIPZ 等常见载体）；

是否正确构建了：sense-loop-antisense 的发夹结构；

是否使用了常规loop序列（如 TTCAAGAGA）；

可以尝试换用 validated 的shRNA序列（如来自Sigma的TRC库）。

2. 表达量过高导致饱和效应

你提到荧光很亮，可能病毒感染后表达过强；

高表达可能导致 shRNA 的处理机制（如 Dicer、RISC）饱和或异常；

shRNA过量还可能引起off-target效应或细胞应激反应，间接影响 knockdown 效率。

建议：

稀释病毒量（MOI降低）；

用 inducible（可诱导）表达系统（如Tet-on）来控制shRNA表达；

检查是否有细胞毒性或应激反应的迹象（如生长变慢）。

3. 表达时空不同（时间或细胞类型）

siRNA敲低是短期的，而shRNA表达是持续的；

某些目标基因可能存在补偿机制或反馈调节机制，慢病毒长期表达后会诱导反调机制使得蛋白水平恢复。

建议：

多做几个时间点检测（比如感染后48h、72h、96h）；

检查mRNA水平（qPCR）看是否是蛋白翻译的问题而不是转录的问题。

4. 病毒构建或包装问题

虽然有荧光，但不代表shRNA功能部分没有突变或剪切错误；

需要确认病毒载体中shRNA序列确实无误且表达。

建议：

检查病毒载体中shRNA的序列是否正确（测序确认）；

检查是否有突变、插入缺失等构建错误。

总结建议：

排查方向 具体操作
shRNA结构设计是否规范 检查sense-loop-antisense是否正确
病毒表达是否过量 降低MOI，或使用可诱导系统
是否成功敲低mRNA 做qPCR确认，不仅看蛋白
序列是否有误 测序验证病毒质粒中的shRNA
换用已验证序列 使用文献中或供应商提供的有效shRNA序列