2024年 7月 23日, 星期二
新闻

DNA 的 PCR 扩增

一、 PCR反应体系的组成

1.PCR扩增缓冲液:

50mM     KCl
10mM    Tris HCl( pH8.0)
1.5mM   MgCl2

2.寡核苷酸引物:是按已知待扩增的DNA 片段序列进行设计,用 DNA合成仪合成。引物序列应位于DNA片段的保守区,两条引物间应注意不要有互补序列,单条引物内应防止出现发夹结构。引物最好为20~24个核苷酸,最少不能低于16个,其浓度通常为50~100pmol。

3.脱氧核苷三磷酸:dNTP(dATP 、dCTP 、dGTP 和 dTTP)在饱和浓度(每种 dNTP
浓度为200μmol) 下使用。

4. Taq DNA聚合酶。

5. 单、双链 DNA 或 RNA 都可作为PCR的样品,若样品为RNA,须先通过逆转录将mRNA 转录成cDNA ,然后进行扩增。
虽然 PCR 扩增可用极微量样品,甚至来自一个细胞的DNA,但为了保证反应的特异性,还应用足够量DNA。DNA模板可以是粗制品,但不能混有任何蛋白酶、核酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白。

DNA 扩增反应体系一般为 25μl 或 50μl 体积,按下列顺序加入各成分后进行扩增。

ddH202           12μl
10 X buffer      2.5μl
4 X dNTP         1μl
引物Ⅰ             1μl
引物Ⅱ             1μl
模板DNA         5μl
石蜡油            25μl
95℃变性10min后
加Taq DNA聚合酶 2.5μl(含0.25-1u酶)

二、PCR循环

首次循环:95℃ 变性 10min后加Taq DNA 聚合酶
后续循环:94℃ 变性 60s,50 ℃退火60s,72 ℃延伸90s
                 共25或35个循环
末次循环:72℃延伸10min,结束循环
每次循环均应设阳性对照和阴性对照。

PCR扩增除单轮扩增外,还有双轮扩增亦称半重叠扩增或称半巢式扩增及巢式扩增。

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