2024年 7月 23日, 星期二
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DNA 序列测定——化学(Maxam-Gilbert) 测序法

在Maxam 和Gilbert 发展的DNA 化学测序法(1977, 1980) 中,碱基专一性化学试剂在一种或两种特定核苷酸位置上随机断裂已纯化的3’端或5′ 端标记的DNA, 产生4 套寡聚脱氧核糖核苷酸。因为只有末端标记的DNA 片段才能在测序胶的放射自显影图中显示出来,所以只能观察到含有固定末端的片段,这样就产生了4 列DNA 阶梯,见图1

图1 化学测序法。图中表示4 个化学裂解反应产物经凝胶电泳分离后的寡核苷酸阶梯。星号(*)表示32 p 在5’端标记的位置,凝胶中DNA 片段3′ 端加阴影的碱基表示经化学修饰后,在哌啶介导的链剪切过程中从核苷酸链上被取代的碱基。例如, DNA 与DMS 进行有限的反应后,接着的哌啶处理引起被修饰G 的定量释放,产生的寡核苷酸链都是以在序列中紧接脊G 的碱基为末端。本例中的产物是 *pGpApTpCpGp 和*pGpApTpCp, 每一产物分别在“G” 泳道形成条带。至于*pG,其产物是*p, 很可能已跑出胶外,因而很难确定5’端碱基。由于甲酸对嘌呤的特异反应,终止于G或A 的片段在“G+ A” 泳道形成条带。因此,终止于G 的片段会出现在G+ A 和G 泳道上,但是终止于A 的片段只会出现在G+A 泳道上。同样,通过分析在T+C 和C 泳道上是否存在T 和C 也可以分辨出这两个碱基(在NaCl 存在和不存在的情况下用阱处理)。

碱基修饰和链断裂在两个分开的反应中进行。化学法的特异性基于第1 步反应中肼、硫酸二甲酯或甲酸对碱基的修饰:
G:DMS 使鸟嘌呤的第7 位氮原子甲基化,其后断开第8 位碳原子和第9 位氮原子间的化学键。
G + A :甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化,削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键。
T+C :肼断开了嘧啶环。
C : 在NaCl 存在时,只有C 才能与肼发生反应。
在所有的4 个反应中,哌啶随之从核糖分子上置换了修饰的碱基并催化了这个位置上磷酸二酯键的断裂。这个反应必须是定量的。DNA 阶梯可以通过4 条泳道的比较而读出来。G + A 泳道中的A 片段如没有出现在G 泳道则读作A; 出现在T+C 泳道但没有出现在C 泳道的片段则读作T (图1) 。

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