2024年 7月 23日, 星期二
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单克隆抗体的制备——杂交瘤的建系

在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前,应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量,可以选择其中20 个最佳的候选孔。在检测这20 个孔的培养上清为阳性后,应该将这些孔的细胞进行冻存,同时进行有限稀释。

附加材料

  • 生长的杂交瘤
  • 克隆和扩增用培养基
  • 24 孔板
  • 4ml 有盖试管,无菌

步骤

  1. 当96 孔板中生长的杂交瘤长到2 5%~50 %汇合时(主要孔),用无菌的移液器(调节为100μl 的微量移液器)将主要孔中的细胞重悬,并将孔中全部内容物转入24 孔板的—个孔,保证有足量的细胞在此扩增孔中扩增。若是从一个长有成纤维细胞的孔中转移细胞,应该尽早进行转移操作,以免成纤维细胞过度生长,并且操作时切忌刮到孔底(这样做会松动成纤维细胞) 。
  2. 用1ml 移液器在主要孔中滴入3 滴添加10 mmol/L HEPES 和1mmol/L 丙酮酸钠的 DMEM-20 完全培养液,放回CO2 培养箱培养。
  3. 用干净的移液器取1~1. 5ml 用于克隆和扩增的培养基加入24 孔板, CO2培养箱培养2~3d 。主要孔与扩增孔要用不同的移液器从不同的试剂瓶中取用培养基。
  4. 当24 孔板中的细胞长到 25 %~50 % 汇合时(2 ~3 d ) , 用有限稀释技术进行克隆操作 。而当主要孔中的细胞长到2 5%~50 %汇合时,必要时可重复步骤1~3 。
  5. 完成有限稀释操作之后,将24 孔板中多余的细胞移入4ml 无菌有盖试管中。用添加 HEPES 和丙酮酸钠的DMEM-20 完全培养液继续培养24 孔板中的细胞。
  6. 将前述4ml 管于室温, 500g 离心5min 。将上清保留以备进一步抗体鉴定或作为对照。冻存细胞沉淀 。如果已确定建立了稳定的细胞克隆,那么细胞建系就完成了 ,将其冻存,并确保可被顺利复苏。
  7. 如果有限稀释操作不能培养出有抗体分泌活性的细胞系,则复苏那些之前从24 孔板中分离的细胞。将其重新在24 孔板中培养,过夜,并用这些细胞重新建立有限稀释孔板。将其冻存并妥善保存。

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