2022年 1月 28日, 星期五
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PCR 标记DNA

PCR 是通过热稳定酶,在模板、dNTPs 和一组与片段3′ 序列互补的引物存在下,对插入物进行次序扩增(Saiki et al. 1988) 。PCR 技术提供的另一优势是在对插入片段的扩增中掺入修正的核苷酸,因此可以生产出不含载体的标记的探针,这排除了在其他方法如缺口翻译所导致的对载体序列的非特异性标记。

目前已有掺入生物素化核苷酸的方法(Lo et al. 1988) 。在扩增中掺人dCTP 染料,这一程序是采用BDS 方法,使用知Ampli Taq DNA 聚合酶,并按照描述的程序,用dUTP染料直接标记程序(Yu et al. 1994; Zhu et al. I 988) 。 下面的例子针对于Cy3 – dCTP 典型的标记物产量每个反应达1 ~ 2μg。对于鉴定和试验来说,建立足够的反应数即可

1)准备下列材料

100μg 无离子H20
10μl 10x Ampli Taq缓冲液
4μl 25 mmol/L MgCl2
2μl 10mmol/L dATP
2μl 10mmol/L dGTP
2μl 10mmol/L dTTP
5μl 1mmol/L dCTP
15μl 1mmol/L Cy3TM– dCTP
1μl 100mmol/L 正向引物
1μl 100mmol/L 反向引物
1- 10ng 线性化质粒模板DNA
1μl Ampli Tag DNA 聚合酶(5 单位/μl) ( Perkin-Elmer)

2) 在冰浴0.5ml 灭菌管中,加下列物质并加水至100μl

10μI Ampli Taq DNA 聚合酶缓冲液
4μl 25mmol/L MgCl2
2μl 各种10 mmol/L dATP 、dGTP 和dTTP
5μl 1mmol/L dCTP
15μl  Cy3TM– dCTP
lμl 各种寡核苷酸引物
1 – 10ng 模板DNA
lμl Ampli Taq DNA 聚合酶

轻轻混合,快速离心至管底。
使用无油管或覆盖矿物油

3) 于PCR循环仪中完成,参数如下:

第一循环 (对于插入片段达1kb)
95℃ 4min (预变性)
35℃   循环
95°C 1min (变性)
60℃ 1min (退火)
72℃ 3min (延伸)

最后循环后,完成扩增72℃ 延伸5min

4) 加人33μl 10mmol/L NH4OAc,2倍体积100%乙醇沉淀样品,然后过滤,如果对样品进行沉淀的话, 4℃至少需2 小时。16000g 离心30分钟,然后用 1ml 70%乙醇洗涤,并干燥5 分钟

5) 在25μl 10mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 1 mmol/L EDTA (TE8.0) 悬浮沉淀, 37℃ 温浴20分钟-3 小时。轻混样品, 16000g 离心5 分钟,上清转移至新管,进行鉴定。合井以前各管

6) 产物鉴定

注意事项

  • 活性染料及标记DNA 避光保存,但没有必要黑暗中操作。样品不应长时间(数小时)置于日光下,尤其是强光房间。用锡箔包缠贮存,荧光标记的样品尤其敏感。
  • 在1 %琼脂糖凝胶中,标记探针是可见的,荧光素、德克萨斯红和Cy3 标记探针肉眼易于观察,但Cy5 荧光是处于人视网膜敏感性的边缘,与用标准物多聚核酸梯度(1kb) 比较标记探针比迁移,用0.5mg/ml溴化乙锭染色观察
  • 不同模板的PCR 扩增和标记需要调整MgCl2 浓度、模板含量,循环次数

 

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