2022年 1月 24日, 星期一
新闻

EMSA实验步骤

一、探针的标记

  1. 如下设置探针标记的反应体系:

(1)待标记探针 (1.75 pmol/μl) :2μl

(2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) :1μl

(3)Nuclease-Free Water :5μl

(4)[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) :1μl

(5)T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) :1μl

(6)总体积:10μl

(7)按照上述反应体系依次加入各种试剂,加入同位素后,Vortex混匀,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混匀。

  1. 使用水浴或PCR仪,37℃反应10分钟。
  2. 加入1μl 探针标记终止液,混匀,终止探针标记反应。
  3. 再加入89μl TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上,即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见,通常不必测定探针的标记效率。
  4. 标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。

二、 探针的纯化

通常为实验简便起见,可以不必纯化标记好的探针。在有些时候,纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化,可以按照如下步骤操作

  1. 对于100μl 标记好的探针,加入1/4体积即25μl 的5 M醋酸铵,再加入2体积即200μl 的无水乙醇,混匀。
  2. 在-70℃至-80℃沉淀1小时,或在-20℃沉淀过夜。
  3. 在4℃,12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清,切不可触及沉。
  4. 在4℃,12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀,但不宜过分干燥。
  5. 加入100μl TE,完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。

三、EMSA 胶的配制

  1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具,或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果,可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。
  2. 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意:使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。

(1)TBE buffer (10X): 1ml      重蒸水:16.2ml

(2)39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v): 2ml

(3)80% 甘油: 625μl

(4)10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) :150μl

(5)TEMED :10μl

  1. 按照上述次序加入各个溶液,加入TEMED前先混匀,加入TEMED后立即混匀,并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡, 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

四、EMSA结合反应

  1. 如下设置EMSA结合反应

阴性对照反应:

(1)Nuclease-Free Water :7μl

(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2μl

(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子: 0μl

(4)标记好的探针 :1μl

(5)总体积 :10μl

样品反应:

(1)Nuclease-Free Water :5μl

(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2μl

(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 :2μl

(4)标记好的探针: 1μl

(5)总体积: 10μl

探针冷竞争反应:

(1)Nuclease-Free Water :4μl

(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2μl

(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子: 2μl

(4)未标记的探针: 1μl

(5)标记好的探针: 1μl

(6)总体积 :10μl

突变探针的冷竞争反应:

(1)Nuclease-Free Water :4μl

(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2μl

(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 :2μl

(4)未标记的突变探针: 1μl

(5)标记好的探针: 1μl

(6)体积 :10μl

Super-shift反应:

(1)Nuclease-Free Water:4μl

(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) :2μl

(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子:2μl

(4)目的蛋白特异抗体 :1μl

(5)标记好的探针:1μl

(6)总体积 :10μl

  1. 按照上述顺序依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温(20-25℃)放置10分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针,混匀,室温(20-25℃)放置20分钟。
  2. 加入1μl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样。注意:有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合,建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液,至能观察到蓝颜色即可。

五、 电泳分析

  1. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔,可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色),以观察电压是否正常进行。
  2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色),用于观察电泳进行的情况。
  3. 按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃,如果温度升高,需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处,停止电泳。
  4. 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板,用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注:通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板),把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶,轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟),轻轻揭起滤纸,这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下,放平,在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜,确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
  5. 干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测,或用其它适当仪器设备检测。

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