兔胸主动脉平滑肌细胞的原代培养

由于心血管系统发病率、病死率高，严重威胁人类生命，随着心血管疾病研究的不断深入，以体外培养的血管平滑肌细胞作为研究模型，在心血管疾病，特别是在动脉粥样硬化研究中的应用越来越广泛。

（一）材料与设备

1. 设备超净工作台、离心机、水浴锅、CO₂ 培养箱、－70 ℃ 冰箱，－20 °C:冰箱。
2. 无菌材料培养皿、止血钳、15ml 离心管、刻度吸管、弯头吸管、T25细胞培养瓶、高糖DMEM 培养液、胎牛血清、青／链霉素、D-Hanks 溶液、0.1%胰蛋白酶、2kg 成年家兔（大耳白）胸主动脉。

（二）操作步骤

1. 无菌条件下取胸主动脉，用D-Hanks 溶液洗净血污，清理去除外膜杂组织，然后移入小培养皿内，用含双倍双抗的D-Hanks 溶液洗2 次。
2 . 用剪刀剖开成单片，加0. 1％胰蛋白酶，于37℃ 消化20min , 其间每5min摇晃1 次。
3 . 弃悬液， 将组织剪碎至1mm³， 移入青霉素小瓶，然后吸入D-Hanks 溶液洗2~3 次。
4. 将组织块移入T25 细胞培养瓶，用弯头吸管将组织块轻轻剥离成单块，并均匀贴附在瓶壁，然后将贴附有组织块的培养瓶移入培养箱，翻转倒置4~6h ,至组织块贴牢。
5 . 加入6~8ml 含20％胎牛血清的DMEM 培养液，于37°C 、5% CO₂ 培养箱中培养。
6. 3~7d 后于镜下观察，组织块周围会有细胞长出，细胞长多后就可看到“生长晕”。
7 . 原代培养过程中， 应保证每3d 换1 次培养液，细胞长至7~10d 时可进行第一次传代。以后每3~4d 传代1 次，按常规l : 3 传代方法进行操作。

（三）细胞鉴定

平滑肌细胞特征性表达αSMA, 细胞免疫化学染色呈阳性。

（四）小结

注意，血管外膜应尽可能剥离干净，以避免成纤维细胞混杂其中。此方法培养的平滑肌细胞纯度可达99%。若培养条件良好，且有规律的传代， 则平滑肌细胞可传代23 代。