2022年 1月 28日, 星期五
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采用dsRNA 浸泡果蝇S2 细胞进行RNA 干扰

该方案是一种通过用含有dsRNA 的培养液浸泡果蝇S2 细胞来诱导RNA 干扰的简便方法。与转染方法相比,浸泡操作需要的步骤更少,因此可用于高通量的RNA 干扰筛选。而且, 浸泡避免了转染试剂可能带来的毒性,但是,通过浸泡向果蝇S2 细胞转运dsRNA 的效率与转染方法相比较低。对于通过浸泡dsRNA 难以抑制其表达的基因,可以通过多次转染dsRNA 获得抑制作用。本方案介绍的浸泡方案用于6 孔板内培养的细胞。如果使用其他规格的多孔板、培养瓶或者培养皿,需要根据培养孔的表面积换算细胞密度和试剂用量(表1) 。

表1 果蝇细胞浸泡所用细胞、 转染试剂和siRNA ( 或者ASO) 的体积

试剂
果蝇Schneider 2 ( S2 ) 细胞
dsRNA ( 1μg/μL)
热灭活的胎牛血清(FBS )
Schneider ‘ s 果蝇培养液

设备

锥形离心管( 50mL )
免疫荧光、Western 印迹、定量RT-PCR 或者Northern 杂交用设备(步骤8)
层流生物安全柜(II 级)
体视显微镜
组织培养皿( 10cm )
组织培养箱( 25 °C) ,一定湿度
组织培养板(6 孔)

方法

制备浸泡用细胞
1. 用含有10%胎牛血清的Schneider ‘s 果蝇培养液培养S2 细胞,细胞在25 °C 湿润培养箱中生长至5 X106~ 10 X 106 个干细胞/mL 。
2. 室温下1000g 离心3min, 弃去上清,将细胞重悬于无血清的Schneider’s 果蝇培养液中, 密度为1 X 106 个细胞/mL 。
3 向6 孔板每孔中加入lmL 细胞悬液(1 X 106 个细胞)。
4 在25 °C 湿润的培养箱中培养细胞。

dsRNA 浸泡细胞和基因敲减效果分析
5 向每孔细胞中加入15 ~ 30μg dsRNA 。轻轻地前后直线移动培养板。不要旋转,以免使中间的细胞脱落而影响细胞摄入dsRNA 的效果。
6 细胞在25 °C 湿润的培养箱中孵育30min 。
7 每孔加入2mL 含有10%胎牛血清的Schneider’s 果蝇培养液。
8 细胞在25 °C 湿润培养箱中培养2 ~ 6 天。对基因敲减效果的分析: 通过免疫荧光和Western 印迹法 ,利用特异性识别目标蛋白的抗体检测目标蛋白表达的减少量,以及通过定量RT-PCR 或者Northern 杂交检测目标mRNA 的减少量。

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