2022年 8月 17日, 星期三
新闻

通过MTT 法分析细胞活力

在众多依赖于活细胞将底物转化为生色产物的活力检测方法中,由Mossman ( 1983 )建立的MTT 法仍是最通用、最流行的方法之一。在MTT 法中,水溶性的黄色染料MTT [3-(4 , 5 - 二甲基噻唑-2)-2 , 5 -二苯基四唑溴盐] 在线粒体还原酶作用下转化为不溶性的紫色甲臜( 图1 ) 。随后甲臜被溶解,其浓度通过570nm 下的OD 值被测定。检测结果很灵敏,直至每孔约106 个细胞仍有良好线性。与alamarBlue 法一样,代谢活性方面的微小变化能够在MTT 中产生很大的变化,使得能够检测无直接细胞死亡的毒性试剂处理所致的细胞应力。该方法已针对生长于多孔板中的贴壁或非贴壁细胞进行了标准化。本方案使用标准96孔板,但可进行放大以适应不同规格的培养板。在96 孔板每孔中接种500 ~ 10000 个细胞。该方法直至106 个细胞仍有很好的线性。

图2 MTT 还原为MTT 甲臜

试剂

转染的哺乳动物细胞

DMSO

MTT 储备溶液

SDS-HCl 溶液( 10% )

组织培养基

设备

96 孔板,标准平底

96 孔板, V 形底或圆底

能够读取多孔组织培养板的分光光度计

方法

标记细

1. 对于贴壁细胞, 除去培养基, 更换为l00μL 新鲜培养基。对于非贴壁细胞,离心微孔板使细胞沉淀,小心地尽可能除去培养基,更换为l00μL 新鲜培养基。

细胞培养基中的酚红指示剂会干扰MTT 反应。可能需要在无指示剂的培养基中培养细胞,或者在加入MTT 试剂之前更换为无指示剂的培养基。

2 . 向每孔加入l0μL 12mmol/L MTT 储备溶液。再做一个单独的l00μL 培养基中加入l0μLMTT 储备溶液的阴性对照。

3. 将培养板于37°C 孵育4h 。细胞密度较高时( 每孔大于100000 细胞) , 孵育时间可缩短至2h 。用SDS-HCl 或DMSO 溶解产生的甲臜。

用SDS-HCl 溶解甲臜

4. 向每孔加入l00μL SDS -HCl 溶液,用吸管彻底混匀,产生的甲臜被溶解。

5. 将微孔板于37°C 湿润温箱中孵育4 ~ 18h , 时间的长短取决于形成的甲臜产物的多少。孵育时间过长会降低检测的灵敏度。

6. 用吸管再次混匀每个样品,于570nm 处读取吸光度。

用DMSO 溶解甲臜

DMSO 是一种比SDS-HCl 更迅速、更常用的溶解试剂。

7 . 从孔中吸出培养基,仅余25μL 。

对于非贴壁细胞, 可能需要首先离心培养板以沉淀细胞。

8 . 向每孔加入50μL DMSO , 用吸管彻底混匀。

9 . 将培养板于37°C 孵育lOmin 。

10 . 再次混匀每个样品, 于540nm 处读取吸光度。

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