2022年 1月 28日, 星期五
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肿瘤细胞的原代培养

由于不同人种、不同民族的遗传基因不同,所以对不同疾病, 特别是对复杂疾病的易感性、对各种药物的耐受性和对各种环境因子的反应也不同,建立国人肿瘤细胞株, 可为国人疾病的诊断、防治及药物开发提供肿瘤模型。

(一)材料与设备

1. 无菌材料眼科剪,眼科镂, 一次性培养皿,细胞培养瓶T25 、T75 , 冻存管,一次性小滤器, 一次性离心15~50ml, 高糖DMEM 培养液, 1% 1V型胶原酶,青/链霉素,胎牛血清,二甲基亚砜,冻存液。
2. 设备超净操作柜/台、CO2 培养箱、4 ℃ 冰箱、-70°C 冰箱、离心机、相差显缴镜及照相设备。

(二)操作步骤

无菌条件下,取肿瘤手术切除的肿瘤组织,置于50ml 含双倍双抗试液D-Hanks溶液的离心管中,并尽快运输到实验室,尽快进行以下操作。
1. 在超净操作台中,将肿瘤组织从离心管中移出,在10cm 的培养皿内,将脂肪、出血部分剔除,将肿瘤组织块用D-Hanks 溶液(含双倍的双抗试液)清洗干净,将组织移入另一无菌培养皿内。
2. 用无菌剪刀将组织剪碎至2~3 mm3 大小,用D-Hanks 溶液将剪好的组织块清洗2 次,然后将组织块移入15ml 离心管中,经350g 离心8min 后,弃去上清液,加3ml IV型胶原酶混匀, 37°C 水浴15min, 每5min 震荡1 次。
3. 当酶液变混浊时(在显微镜下可见大量游离细胞) ,轻吸上清液移入另一无菌离心管并加入含血清的高糖DMEM培养液终止反应。
4 . 未消化完的组织块再加入新鲜消化液,重复此步骤2~3 次,直至大部分细胞被消化下来,消化好的细胞悬液混匀,经350g 离心8min, 弃去上清液,并用D-Hanks 溶液洗涤2 次。
5. 将细胞溶解于8ml 高糖DMEM 完全培养液中,接种于T25 细胞培养瓶中。
6. 细胞培养在37°C 、5% CO2 培养箱中, 48h 后换液,弃掉未贴壁细胞。每2~3d 换液1 次,待细胞长满后传代培养。
7. 在细胞扩增到不同代数时,可将部分细胞的进行冻存。一方面尽早保存一些细胞,便于日后对比观察、鉴定,另一方面可做些储备,以防微生物污染或发生细胞交叉污染。

(三)细胞形态学鉴定

将细胞接种在直径10cm 培养皿中的盖玻片上至细胞汇合(放入5% CO2 、95% 湿度的培养箱中培养),根据需要作CK、HE 等染色。

(四)试剂的配制

1. 抗生素的配制   青霉素和链霉素, 一般配制浓度均10000U/ml 和10000μg/ml,用无菌的D-Hanks 溶液或生理盐水溶解,分装小瓶, 5ml/瓶, -20℃ 冰箱保存备用。用时每100ml 完全培养液加1ml双抗试液(每毫升培养液含宵霉素100U/链霉素100μg )。
2. 完全培养液的配制   高糖DMEM 培养液+ 10%胎牛血清+1%双抗试液。
3. 冻存液的配制   30%的胎牛血清, 5%的二甲基亚砜,分装, -20℃冰箱保存备用。使用时1ml 可冻存一管。

(五)小结

1. 做好详细的实验记录。
2. 注意无菌操作并防止细胞间的交叉污染。
3. 细胞每传7~8 代冻存1 批,并记录清楚代数。
4. 20 次以后,进行全面鉴定。

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