2022年 8月 17日, 星期三
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缺口翻译标记DNA

下面程序描述了使用修饰染料核苷酸,用同步DNA 切割通过缺口翻译制备荧光DNA,缺口翻译是通过摸索修饰dUTP 和dTP 的荧光素或花青的最佳条件完成的(Keller 1993; Yu et al. 1994; Zhu et al. 1994) 。该方法对用四甲基罗丹明、德克萨斯红、香豆素和bodipy 修饰的核苷酸可能也适用,但染料的类型、接头、核苷酸以及聚合酶的种类对标记物的掺入效率和标记DNA 产量都有一定影响(Yu et al. 1994; Zhu et al. 1994) 。下面提供了由Biological Detection Systems开发的一种方法。

1) 准备下列材料

  • 250μl 去离子H20 (DI-H20)
  • 25μl 10x 缺口翻译缓冲液(NTB) 含有0. 5mol/L Tris-HCl (pH7. 2)
  • 0.1 mol/L MgSO4,1mol/L DTT
  • 25μl 200mol/L dNTP 标记混合物含200μmol/L 各种未标记的dATP 、dGTP 和dTTP调至pH7.0
  • 5μl 1 mol/L 荧光素-dCTP
  • l0μg DNA 模板;例如完整质粒、纯化片段或PCR 扩增产物
  • 25μl DNase I, 在1x NTB 中含3.33mU/ml
  • 100 单位大肠杆菌DNA 聚合酶I
  • 42μl 10 mol/L NH4OAc
  • 333μl 100%乙醇(4℃)
  • 1μl 70% 乙醇(4℃)
  • 25μl TE缓冲液,(pH8.0)
  • 1%常规琼脂糖1 x TBE 凝胶鉴定标记产物

2) 将装有去离子水(终体积达250μl) 的0.5ml 小管冰浴、加人25μl 的10 x TVTB,25μl 200 mmol/L dNTP 标记混合物, 5μl 1mol/L 荧光dCTP, 10μg DNA 模板, 25μl稀释的DNase I,和100 单位E. coli DNA聚合酶,用加样器上下轻轻混合几次

3)16℃温浴1小时

4) 将样品分为两份(每份125μl) 于1.5ml 小管中,加42 μl 10 mol/L NH4OAc并加333μl 100%乙醇(4℃) ,混合,冰浴至少2h, 样品置4℃过夜

5) 16000g 4℃ 离心30min, 弃上清,用1ml 冰冷(4℃) 70% 乙醇冼涤沉淀

6) 真空干燥,直至除去所有液体(约5min)

注意:不要干透

7) 加25μl TE (pH8.0) 于每个管中,37℃ 温浴20min 至3 小时,振荡并用加样器吹打使颗粒溶解

8) 16000g 离心5min, 上清移至新管

9) 取10μl 鉴定,其余贮存于 -20℃

10) 产物鉴定。

目的是测定DNA 中携带荧光物百分率 (L%) 以及按照程序产生所标记DNA产量

 

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