2022年 1月 28日, 星期五
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细胞的支原体检测——荧光指示细胞法

常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱,其激发波长为350nm(紫外激发),发射波长为420nm。该染料会结合到DNA 中富含A-T 的区域,由于支原体的DNA中A-T 含量占多数(55%~80%),所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点,即为支原体DNA, 证明该细胞有支原体污染。

由于各种细胞的形态和培养状态都有差别,所以为了便于比较、观察, 该方法一般使用贴壁细胞VERO (非洲绿猴肾细胞)作为指示细胞,即将待检割细胞的新鲜上清液加入支原体阴性的VERO 细胞中培养48h ,然后固定、染色、观察。

(一)材料与设备

1.荧光显彼镜。
2.CO2 培养箱。
3.无菌小爬片。
4.无菌培养皿。
5.不含抗生素的完全培养液。
6.二苯甲酰胺荧光染料浓缩液(50μg/ml) 。称取5mg 二苯甲酰胺荧光染料加入100ml 不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液中,在室溫下用磁力搅拌30~40min, 使完全溶解,-20℃ 避光保存。
7.二苯甲酰胺荧光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1ml 上述浓缩液,加至100ml 无酚红和碳酸氢钠的Hanks 溶液中,终浓度为0.5μg/ml 。
8.固定液,即乙酸:甲醇(1 : 3) 溶液为细胞固定液。
9.封片液。0.1mol/L枸橼酸22.2ml, 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml, 丙三醇50.0ml,以上三者混匀,调pH 至5.5 。
10.不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液或PBS 。经多种方法检测确定为支原体阴性的VERO 细胞。

(二)操作步骤

1. 无菌收集待测细胞上清:悬浮细胞离心后取上清液。

2.VERO 细胞爬片:将小爬片无菌置于小培养皿内,滴加VERO 细胞悬液

(细胞浓度约3×104 个/ml) 2~3ml, 置于CO2 培养箱内培养24h 使其贴壁。

3.制备标本。向6 孔板内滴加待检细胞上清液约1ml, 注意设立对照组(已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液),培养48h 后( VERO 细胞汇合前)将细胞爬片从平皿中取出。

4.漂洗。将细胞爬片置于培养皿中,用不含酚红、NaHCO3 的Hanks 溶液(或PBS) 漂洗3 次。

5.固定。用乙酸:甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。

6 . 漂洗。待固定液自然风干后用去离子水漂洗3 次。

7.染色。置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 。

8.漂洗。去离子水中漂洗3 次,每次1 ~2min 。

9.封片,紫外激发,观察。

(三)结果判断

当阴性及阳性对照结果均成立时,结果有效 。

1. 阴性结果 仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。
2 . 阳性结果 荧光显缴镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等、不规则的蓝色荧光小点和丝状点。

(四)小结

1 . 严格配制工作液及封片液。
2 . 保证作为指示细胞的VERO 细胞没有被支原体污染。
3 . 必须同时设立阳性及阴性对照, 井注意重复,以排除假阳性和假阴性结果。
4. 应全面观察爬片,并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体还是支原体污染。
5. 可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间,避免出现非特异性染色,如胞浆着色。

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