2022年 1月 28日, 星期五
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碱变性法提取质粒DNA

质粒DNA提取的方法很多,有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭 – 氯化铯梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种,但基本原理和步骤是一致的.包括以下步骤:(1)裂解菌体细胞;(2)质粒和染色体DNA的分离;(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分;(4)除去提取过程中使用的去垢剂、盐等。

一、原理

采用碱变性法提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、步骤

  1. 挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌,接在含有100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基(5ml/15ml试管)中,37℃震摇培养过夜。
  2. 将5ml菌液加入微离心管中,14000r/min,离心10秒,取上清液。反复数次,收集全部菌体。
  3. 倾去上清,滤纸吸干。
  4. 加30μlTE缓冲液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L   EDTA,pH8.0),振荡起菌体。
  5. 加30μlTENS溶液(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0,1mmol/L   EDTA,0.1mol/L  NaOH,0.5%SDS),震荡10秒至溶液变粘稠。
  6. 加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3-5 S,14000r/min,离心3分钟,沉淀细胞碎片及染色体DNA。
  7. 上清液转移至另一微离心管中,同等体积胞和酚,混匀,12000r/min,离心2分钟。
  8. 上层水相转移至另一位离心管,加2倍量冰乙醇,14000r/min,离心20分钟。
  9. 倾去乙醇,加入70%冷乙醇淋洗。
  10. 倾去乙醇,滤纸吸于,真空抽吸2~3分钟。
  11. 加人50μlTE缓冲液,溶解DNA。
  12. 加入1μl核糖核酸酶(10mg/m1),14000r/min,离心2s,使核糖核酸酶与管底液体混匀。
  13. 37℃水浴30min。
  14. 样品放-20℃冰箱保存备用。

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