2022年 1月 28日, 星期五
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直接克隆法构建重组腺病毒基因组

pShuttle 质粒被用来将携带的目的基因转移到腺病毒载体骨架中。步骤1 ~9 阐述了将目的基因克隆到有双筛选系统的pSh-pkGFP 质粒中。目前在使用的pShuttle 或pSh-pkGFP 中包含一个CMV 启动子驱动的表达盒,,可以用来克隆外源基因或替换启动子。
1. 在无菌的05mL 离心管中将外源基因载体和pSh-pkGFP 载体分别用以下条件消化:

DNA 1~2μg
限制性内切核酸酶A 0.5μL
限制性内切核酸酶B 0.5μL
限制性内切核酸酶缓冲液(10X) 2.0μL

加水至总体积达2 0μL , 混匀, 37 °C 水浴lh 。

2. 取2μL 消化产物在1 %低融点琼脂糖凝胶中电泳,分析确认条带与质粒图谱一致。
3. 按照说明书用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化pShuttle 骨架。
4. 将余下18μL 消化产物通过1%LMA 凝胶电泳分离条带,将含有插入的外源基因和穿梭载体骨架的条带切下,分别装在2 个1.5m.L 离心管中。
5. 将装着凝胶的离心管置于65°C 热激3~5min 。凝胶融化后按照下文所述准备连接反应:

穿梭载体骨架DNA DNA总体积为10μL(最多为200ng)
拟插入的外源基因DNA 骨架:插入片段的分子比例为1:3
T4DNA连接酶(5UμL) 4μL
连接酶缓冲液(5X) 4μL
ATP(20mmol/L) 4μL
H20 4μL

连接反应混合物应在16℃过夜。

6. 第二天将连接反应物放在65 °C 热激3 ~ 5mm ,加入40μL 的S X KCM 缓冲液与140μL无核酸酶水,吹打混匀。冰上放置3 ~ 5mm 。将一个14mL 聚丙烯圆底试管放在冰上预冷。
7. 将DHSa E.coli 感受态细胞放在冰上融化,在SOμL 感受态细胞中加入25μL 稀释后的连接产物,将混合物加入圆底试管底部轻柔混合,冰上转化至少30min 。按照感受态细胞的说明书完成余下步骤。然后将加了50mg/L 卡那霉素的感受态细胞铺在LB 琼脂糖培养皿上, 37 °C 孵育过夜。
8. 将LB 培养皿放在UV 显微镜下,通过FITC 通道在510nm 波长下观察。在紫外光的激发下,已经被pSb-pkGFP 成功转化的质粒会发出绿色荧光。在其中挑选白色克隆放在2mL 的LB 培养基中( 含50mg/L 卡那霉素), 37 °C 摇床培养18h 。
9. 用小提质粒试剂盒从细菌培养物中提取质粒DNA 。用限制性内切核酸酶消化法鉴定确认pShuttle-Transgene 阳性克隆的质粒DNA 结构是否正确。

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