2022年 8月 17日, 星期三
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微型凝胶电泳后使用溴化乙锭(EB)估算条带中DNA 数量

此方案概述了一个快速定量DNA 的方法,并同时分析其物理状态。溴化乙锭染色后,用UV 灯照射透视法可以发现包含>5ngDNA 的DNA 条带。CCD 照相机拍下未知样品的影像,然后与一系列已知含量标准品进行强度(灰度)对比,从而估计未知样品中DNA的含量。染色凝胶分析是一种快速的同时测量DNA 的数量并分析其物理状态的方式。

SYBR 染料也可用于染色并大致确定凝胶条带中DNA 的含量。然而,不同于溴化乙锭,SYBR 染料只能用于电泳后染色。通常情况下,凝胶需浸入含有染料在溶液中至少1h, 这给实验者造成不方便。

试剂

含溴化乙锭(0.5μg /mL) 的微型琼脂糖凝胶( 0.6% )

DNA 样品

DNA 标准品(见步骤2)

电泳缓冲液(通常为1 XTAE<A>或0.5XTBE<A>)

凝胶上样缓冲液IV<A>

MgCl2 ( 1.0 mol/L)

设备

琼脂糖凝胶电泳设备

凝胶短波紫外光照射下拍摄设备

能提供500V/200mA 的电源设备

方法

  1. 将2mLDNA 样品与0.4mL 上样缓冲液IV 混合,注入含溴化乙锭(0.5μg/mL) 的微型琼脂糖凝胶(0.6% )狭槽中。
  2. 将一系列2mL DNA 标准品(0 、2.5mg/mL 、5mg/mL 、10mg/mL 、20mg/mL 、30mg/mL 、40mg/mL 和50mg/mL) 与0.4 mL 上样缓冲液IV 混合,同样注入凝胶孔中。
  3. 进行电泳, 直至溴酚蓝迁移1 ~ 2cm 。
  4. 凝胶放入含有0.01 mol/L MgCl2 的电泳缓冲液浸泡5min 脱色。
  5. 在短波紫外光照射下给凝胶拍照。对比标准品的荧光强度估计未知DNA 的浓度。

DNA 样品中可能存在的污染物可以增强或猝灭荧光。为避免出现问题, DNA 样品和标准品可以被置于含溴化乙锭(0.5 mg/mL) 或SYBR Green I 的1 %板式琼脂糖凝胶上。让凝胶站立数小时从而污染的小分子可以弥散开去。然后拍照。

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