2022年 8月 17日, 星期三
新闻

在果蝇S2细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA 功能

本方案描述了将ASO 转入果蝇S2 细胞以便抑制miRNA 功能的方法。通过检测miRNA靶蛋白水平或miRNA 靶基因3UTR 报道基因的活性,可以检测ASO 对miRNA 的效应。本方案是针对24 孔板设计的,若用其他多孔板、培养瓶或不同直径培养皿,应根据其表面积计算细胞密度和试剂体积 。

试剂

ASO ( 12.5μmol/L ) 和错配和/或无关对照寡核苷酸
转染试剂
果蝇Schneider 2 ( S2 ) 细胞
热灭活的胎牛血清( FBS )
Schneider’s 果蝇生长介质

设备

离心机
锥底离心管( 50mL )
免疫荧光和Western 印迹法所需设备(步骤8)
层流生物安全柜(II 级)
体视显微镜
组织培养皿(10cm)
组织培养箱(25 °C), 一定湿度
组织培养板(24 孔)

方法
制备转染所需细胞

制备转染试剂

所有试验应该包含与试验组ASO 侧翼序列一样以及长度相同的错配对照和/或无关对照寡核苷酸。所有体积均表示单一试验孔所需的体积,所有的实验至少重复3 次。对于多孔的转染, 需配置10%的富余试剂以补充混合过程中溶液的损失。
1 向一个含24μL 无血清的Schneider’s 果蝇生长培养基的灭菌微量离心管中加入1μL(12.5pmol ) 实验组或对照组ASO, 移液管轻轻吹打混匀。
2 向一个含24μL 无血清果蝇Schneider’s 生长培养基的另一灭菌微量离心管中加入1 μL  转染试剂, 移液管轻轻吹打混匀。
3 将两管混合液室温放置5min 。
4 将ASO 混合液轻轻加入转染试剂混合液中,移液管轻轻吹打混匀,室温下孵育20min, 从而形成ASO-脂质复合体。

转染和miRNA 抑制效应分析

5. 分别向各个孔的细胞( 来自步骤5) 中加入50μL 的ASO-脂质体转染介质。缓慢地前后直线形移动培养板以混合溶液,不是环形移动,以避免中间的细胞聚集从而降低转染效率。
6 将细胞放入25 °C 湿孵箱中培养1~ 8 天。
8 运用免疫荧光法和Western 印迹法检测蛋白质水平,从而分析miRNA靶基因的表达水平。

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