2022年 12月 6日, 星期二
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做慢病毒感染实验前,你需要哪些知识储备?

慢病毒载体的构建:

慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成,即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白;载体成分则与包装成分互补,即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞,即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。

 

 
(参考:慢病毒载体及其研究进展 图1)

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子。

对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,这就为RNAi,cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。有时病毒感染细胞效率较低,可使用病毒感染增强剂Envirus来提高病毒的感染效率。

慢病毒感染贴壁细胞实验步骤:

1慢病毒转染前18-24小时,将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。
2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基,加入适量病毒悬液。37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时,用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白,一般转染48小时后可见明显荧光表达,72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率,可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选,可以在转染3-4天后开始加药

感染后的细胞检测方法
1、荧光初步检测
若有荧光,则表示病毒感染成功,但并不能确定目的基因是否整合到细胞中,待进一步检测,荧光有强弱之分,与病毒加入的量有关。
2、RNA的提取及RT-PCR检测
3、蛋白提取及Western检测

 在慢病毒感染细胞过程中,会遇到哪些问题呢?

1. 在细胞感染时,MOI是一个非常重要的指标,如何确定MOI值呢?

MOI:复感染指数,是指病毒对细胞的感染能力,MOI越高,细胞越难被感染。通常把某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。

MOI=(病毒滴度×病毒体积)/细胞数目

感染条件及MOI的选择原则:

(1) 在细胞形态不受影响的情况下尽可能用少的病毒感染细胞

(2) 选择感染效率80%左右的作为最佳感染条件

通过细胞感染预实验可以知道慢病毒对细胞的最佳感染条件,来确定细胞的MOI,进行正式实验。

2. 如何解决细胞难感染的问题?

慢病毒对细胞的感染效率受多个因素影响,如细胞自身生长的状态,细胞数量,细胞被慢病毒感染的难易程度等。因此保证细胞正常增殖,轮廓清晰,合适的细胞密度,选择最优的感染条件可以更好的保证感染效率。

对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,可以通过添加病毒感染增强液来显著提高转染效率。EnvirusTM-LV试剂是英格恩生物公司最新研发合成的新型纳米聚合物病毒感染增强试剂(病毒转染试剂)。该试剂采用纳米技术合成,由于纳米技术的应用,EnvirusTM可大大提高慢病毒的感染效率。并且毒性很小,操作简单,可以提高病毒感染能力20-50倍。

此外,对于悬浮细胞,可采用离心感染方法,减少病毒感染时的体积,从而进一步提高感染效率。如将细胞培养板密封后,用平角转子离心机1000g离心1h,再放回培养箱中正常培养。

除了难感染外,加入慢病毒后,细胞死亡也是科研的又一拦路虎。

3. 加入慢病毒后,细胞死亡很厉害,该如何处理?

慢病毒中的杂质是造成细胞毒性的主要因素。一定根据自己的实验需求,选择合适纯度的慢病毒!

如果不幸,遇到了细胞死亡的情况!怎么办?

调整并降低感染的MOI值,并且在感染后4小时、8 小时、12 小时对细胞进行观察;若发现细胞状态变差时,则需要立刻对细胞进行换液操作,使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。

慢病毒的应用:

1. 慢病毒载体介导的RNAi

质粒介导RNAi转染率低、基因抑制表达弱、持续时间短、不适合体内实验等缺点,但LV-RNAi作用持久,同时载体感染细胞的范围扩大,既可用于细胞特定基因功能的研究,还可用于基因治疗,并且两种技术的优势结合,已成为肿瘤性疾病治疗一种全新方法,通过LV将肿瘤的治疗基因安全地转移到靶细胞内,在骨肉瘤、白血病、肝癌、鼻咽癌等种恶性肿瘤中的基础研究中均有广泛的应用。

2. 在肿瘤治疗中的应用

以前列腺癌细胞为研究对象,Yu等把一受雄性激素调控并在前列腺特异表达的启动子和另一EGFP基因插入LV中,并分别转染正常细胞和前列腺癌细胞,结果只在癌细胞中有目的基因EGFP表达,且雄性激素可以促使EGFP的表达而不改变表达特异性。从以上实验研究可以看出,如果LV应用于肿瘤疾病的临床治疗,可能会为疾病的治疗带来新的进展。

3. 神经系统疾病中的应用

   已有大量研究工作表明应用慢病毒载体表达多种神经系统疾病的相关基因,在帕金森病、老年痴呆症、脊髓受损等多种疾病的动物模型中进行长期治疗,已取得良好的效果。

4. 转基因动物模型构建

慢病毒载体技术是培育转基因动物模型的有效工具之一,将目的基因转入宿主细胞后,经过反转录、整合等,能高效地使优势基因在宿主体内得到良好的表达。从而得到需要的带有目的基因的个体。
参考文献:《慢病毒载体及其研究进展》

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