2022年 1月 28日, 星期五
新闻

人胚眙肝细胞的培养

随着各型肝炎、肝硬化、肝癌等慢性肝病的发病率日益升高,体外培养的肝细胞也被广泛地用千肝病基础研究中。尽管细胞培养技术不断改进和成熟,国内外也先后建立了多株人肝癌细胞系,但体外分离和培养人正常肝细胞仍是非常有价值的研究材料。

(一)材料与设备

1. 设备与器材   超净工作台、离心机、CO2 培养箱、-70℃ 冰箱、-20℃冰箱。
2. 无菌材料   大培养皿、青霉素小瓶、50ml 离心管、刻度吸管、弯头吸管、T25 培养瓶、手术剪、刀、镂、细胞筛( 100 目)、消毒用乙醇棉球、流产胚胎、高糖DMEM 培养液、胎牛血清、青/链霉素、D-Hanks 溶液、0.25%胰蛋白酶/0.03%EDTA 消化液。

(二)操作步骤

1. 消化法

(1)流产胚胎引出后, 于4℃ 保存,并尽快运输至实验室。
(2) 将胚胎置大培养皿中,用乙醇棉球将胚胎进行整体擦拭消毒。
(3)持手术镊、剪,从胚胎腹部切口,向下扩,取出肝脏,去除外膜后,用D-Hanks 溶液( 含双倍双抗)洗涤3~5 次,至组织呈灰白色。
(4) 将组织剪碎至1mm3,移入青霉素小瓶,加少量D-Hanks 溶液混匀,用弯头吸管将剪碎的组织移至50ml 离心管中加D-Hanks 溶液清洗,然后以每分1000 转的速率离心6min。
(5)弃去上清液,加入15ml 的0.25% 胰蛋白酶/0.03%EDTA 消化液于室温下消化15min, 然后用吸管混匀,静置几秒钟,待组织块沉淀后弃去上清液。
(6)重新加入新鲜消化液15ml 消化10~15min, 混匀后将上清液(此时悬液中已含有消化下来的细胞)移入另一离心管,并用含20% 血清的DMEM 培养液终止消化,然后向原离心管中重新加入10~15ml 消化液消化,重复3~4 次。
(7) 将消化后收集的细胞悬液混合,过细胞筛。
(8) 筛后的细胞悬液移入离心管中,每分钟1000 转的速率离心6min , 弃去上清液, 用含20%胎牛血清的DMEM 培养液混匀,此时可在计数板计数,然后将细胞悬液按每瓶6~8ml(含细胞量1 x106个)移入T25 培养瓶中,于37℃ 、5%CO2培养箱中培养。次日,观察细胞贴壁情况 , 弃去旧液,用D-Hanks 溶液洗后,换新鲜培养液于37℃  、5%CO2 培养箱中继续培养。
(9)原代培养的第三天,细胞长至80%~90% 汇合时,进行第一次传代。以后每3~ 4d 传代1次。按常规1: 3 传代方法进行操作。

2. 组织块贴壁法

(1) 流产胚胎引出后,于4℃ 保存并运输至实验室。
(2) 将胚胎置大培养皿中,用乙醇棉球将胚胎进行整体擦拭消毒。
(3) 持手术镊、剪,从胚胎腹部切口,取出肝脏,去除外膜后,用D-Hanks溶液(含双倍双抗)洗涤3 ~5 次,至组织呈灰白色。
(4)将组织剪碎至1mm3, 移入青霉素小瓶,然后吸入D-Hanks 溶液清洗2~
3 次。
(5) 将组织块移入T25 培养瓶,用弯头吸管将组织块轻轻剥离成单个,并均匀贴附在瓶壁,然后将贴附有组织块的培养瓶移入培养箱,翻转倒置4~6h, 至组织块贴牢。
(6) 加入6~8ml 含20%胎牛血清的DMEM 培养液,于37°C 、5%CO2 培养箱中培养。
(7) 3~7d 后于镜下观察,组织块周围会有细胞长出,细胞长多后就可看到“生长晕“。
(8) 原代培养过程中应保证每3d 换1 次培养液,细胞长至7~ 10d 时可进行第一次传代。以后每3~4d 传代1 次。按常规1 : 3 传代方法进行操作。

(三)细胞鉴定

胚胎肝细胞可分泌甲胎蛋白(AFP),培养上清液可检测到肝功能检测中的各种酶。

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