Western blot实验最常见的10个问题及解决方案

1、Western Blot原理

Westernblot的原理是蛋白质在电力场的作用下,由大到小的进行排列,利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体(一抗)特异性识别并与之结合。在此基础上,酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗,通过与底物反应显色来观察目的蛋白。

Westernblot显色的方法主要有以下几种:(1)放射自显影,(2)底物化学发光ECL,(3)底物荧光ECF,(4)底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Westernblot显色底物是化学发光底物,发表文章通常也是用底物化学发光ECL

2、目的蛋白信号弱或无

在Westernblot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。首先考虑是否转膜不充分/过转,如果是,则要优化转膜条件;其次,在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低,也可能是底物HRP或底物活性降低,可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。凝胶太厚,曝光时间短也会使蛋白信号降低,因此,要延长转膜时间和胶片的曝光时间。

3、非特性条带

非特异性条带与抗体交叉反应有关。单抗比多抗特异性好,纯度高,另外适当稀释一抗/二抗浓度,也是有必要的。如果样本在处理过程中发生降解,则样本处理时加入蛋白抑制剂在冰上操作。

4、显影后膜上条带处变为黄色或白色

可能是HRP过高导致的敏感性或背景太高,应降低抗体浓度。

5、条带内无显影的白点

一般是与转膜和显影的操作有关,转膜前尽量将膜平衡,并注意胶和膜之间避免气泡,显影时膜与X光片间也应避免气泡。

6、存在散在小圆斑

是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致,解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存,使用时勿混匀,仅用上层。

7、Western Blot化学发光(ECL)淬灭的原因?

Western Blot“淬灭”的原因主要在两方面:含HRP的抗体和发光试剂。由于长期应用某种发光试剂,人们多注意了抗体,不知道发光试剂其实也会对实验结果造成重大影响。对抗体方面来说,可以采用适当降低抗体的浓度,发光实验时快速操作来解决“淬灭”的问题;对发光试剂来说,可以选用发光稳定的发光试剂来解决“淬灭”的问题。

8、Western Blot背景太高

背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题,造成背景深的原因很多。第一,封闭的问题,封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h,但最好4度过夜;实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错,但二抗与牛奶可能有交叉反应,因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一,可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二,TBST洗脱不彻底也会导致背景深,适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色,有时候膜没有完全均匀的浸润也是原因之一。第三,条带背景深也与曝光时间有关,曝光时间超过半小时出现背景是很正常的,所以可以的话建议曝光1-10min。第四,抗体浓度太高也会导致背景高,建议实验前进行检测。

9、Western blot 中Tween-20的作用是什么?应该怎么用?

Tween-20是一种非离子型表面活性剂。用途为水包油乳化剂、可用作溶剂、扩散剂、稳定剂、润滑剂和抗静电剂等。气相色谱固定液(最高使用温度120℃)分离分析挥发油、脂肪酸酯、醇、酮和卤化物。Western blot的操作流程中大部分都用到TBST洗液,而且还是封闭,一抗二抗孵育这种比较关键的步骤。通常Tween-20作为一种非离子型表面活性剂,效果和SDS、BSA作用差不多。由于膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替,因此在封闭时可使用Tween20清除去污剂,而且浓度不要超过0.3%(0.05%效果最好),如果牛奶封闭效果不好可以提高吐温浓度。在WB洗液里的吐温是和BSA一样,对抗原抗体蛋白提供保护作用,同时因为是表面活性剂(司盘加成亲水的环氧乙烷基团后的化合物),可以减少抗体对抗原的非特异性作用,用于洗脱未结合的抗体、减少非特异性结合。Tween-20是我们用TBST的时候Tween-20得用量是0.5ml/L,不加SDS。

10、出现变形条带

凝胶存在气泡或是杂质、电流不稳定、凝胶冷切不均匀。制胶器具和电泳槽保持干净,换新的电解液,保证材料无污染,制胶过程中清除气泡。如电泳槽老化建议换新。尽量选择中间孔加入样品,避免两端上样。

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