2022年 8月 17日, 星期三
新闻

JAM分析

此分析方法基于用[3H] -胸腺嘧啶脱氧核苷标记核DNA, 用玻璃纤维滤器获得样品。 凋亡产生的DNA 片段小到可以通过玻璃纤维滤器,因此特定样品的放射活性减少。很显然,这种分析对循环的细胞是必需的。

  • 实验前一天,将细胞接种于新鲜培养基。对数生长期细胞可更好地掺入[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷。
  • 收获细胞,在新鲜培养基中以1×106细胞/ml重悬,用5 μCi/ml [3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷标记2~4 小时。或者,用1 μCi/ml [3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷过夜标记较低密度的细胞。
  • 用HBSS, PBS 或培养基将细胞洗2次,在培养基中重悬0.2×106-1×106细胞/ml,在开始前确定细胞已被标记。
  • 接种细胞于96 孔平底组织培养板,用推定的凋亡诱导物孵育5 ~ 18 小时。

应在—块板的不同位置(如使用多块板,则每块板的不同位置)设置非处理的对照。培育时间依细胞类型确定,较长的培育时间通常可测定更大量的DNA 片段,但也会使本底增加。

  • 加EDTA 至终浓度为5 mmol/L, 用合适的96 孔板细胞收获仪将细胞收获至玻璃纤维滤器

培养板可直接收获或在-20℃冷冻几天,可用Parafilm 膜密封培养板防止蒸发,收获之前,室温融解培养板。此过程中,将细胞从培养板中冲洗至滤器上,被去离子水裂解。完整的核DNA将结合在玻璃纤维滤器上,而小片段将流过

  • 在80℃烘箱中10分钟或微波4 分钟干燥滤器。
  • 在塑料袋中密封滤器,加人可生物降解的闪烁液至滤器完全浸湿,用β计数仪测定放射活性
  • 按下式计算DNA 片段含量:

DNA 片段(%) = 100% x [ 1-(试验值/对照值)]

注意事项

  1. 试验应作3 次,因为可能观察到由于细胞类型引起的差别。通常板边缘的孔会产生最大的标准差。通常第5 步不需加EDTA, 但加入会减少数值波动。
  2. 如[3H] -胸腺嘧啶脱氧核苷对所用细胞系DNA 标记效率不清楚,建议进行预实验,对细胞作不同密度不同时间的标记处理。在分析中,使用标记良好的细胞波动较低(如大于15 000 cpm/20 000 细胞)。
  3. 也可用这一方法测定细胞介导的细胞毒性或细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞杀伤。在开始CTL 分析前只标记靶细胞。干滤器可在室温长时间存放。重要的是要记住JAM 分析不适用于静止细胞或DNA 只切割成高分子量片段的细胞

推荐

转化细胞在软琼脂中的生长

恶性转化的细胞在许多方面不同于 …

发表回复

您的电子邮箱地址不会被公开。