2022年 9月 28日, 星期三
新闻

DNA 凝胶电泳注意事项

DNA胶用来分离、确定或者纯化DNA片段。用于DNA测序反应的测序胶不在这儿讨论。每位实验室成员有不同的制胶方法。

样品准备

  • 6 X 上样缓冲液: 30% (V/V) 甘油, 0.25%(W/V) 溴酚蓝, 0.25% (W/V) 二甲苯腈蓝,蒸馏水配制。贮于-20’C 。
  • 样品缓冲液与DNA在60’C 温育5 分钟。

标准分子/分子质量标记

  • 琼脂糖凝胶中,指示剂溴酚蓝与分子质量大约600bp的DNA分子一起迁移,而二甲苯腈蓝则与大约4000bp的DNA分子共迁移。确切的迁移与琼脂糖的质量与浓度有关。
  • 溴酚蓝与二甲苯腈蓝也可以用做聚丙烯酰胺凝胶中DNA的指示染料。
  • 市场上有无数的DNA标准分子质量标记。其中大多数是已知DNA酶切产生的片段组合。这些标准DNA标记产生不同大小的片段,使人更容易快速估计未知片段的大小,也提供了胶与胶之间差异的参照。也可以自己制备标准,但是通常太麻烦,不值得这么做。

表1指示剂染料的迁移

  聚丙烯酰胺(%) 溴酚蓝a 二甲苯腈蓝a
聚丙烯酰胺凝胶      
  3.5 100 460
  5.0 65 260
  8.0 45 160
  12.0 20 70
  20.0 12 45
变性聚丙烯酰胺凝胶      
  5.0 35 130
  6.0 26 106
  8.0 19 70-80
  10.0 12 55
  20.0 8 28

a 数值表示与染料共迁移的DNA 片段的大致长度(核昔酸对)

  • 分子标尺是DNA梯子,各大小片段间有一定的间距。最适用于精确测定样品DNA的分子质量。大多数包含有明显可见的参考条带。
  • 保留一份最常用的DNA 标准分子标记。两组有用的DNA 标准标记分别为(bp): λ/ Hind Ⅲ: 23, 130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125

ФX174/ Hae Ⅲ: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118, 72

样式

  • 中型胶盒vs 小型胶盒。小型胶用于监测酶切进程或者查看质粒抽提的质量,这是DNA 胶的两种最大用途。小型胶相对中型胶的优势在于电泳结束的时间较快(不到1 小时,中型胶3~4 小时)以及所需DNA 较少。Southern 印迹在大一点的胶上做较好,因为信号可能较弱需要较多的DNA 。
  • 制备型胶VS 分析型胶。分析型胶用来收集信息。在制备型胶上,感兴趣的DNA 将被取走。制备型胶通常比较大,可容纳大批的样品。一块制备型胶可能只在胶的上端有一个极大的孔。

分离试剂

  • 琼脂糖或者聚丙烯酰胺:分离能力VS 分离范围!
  • 琼脂糖(分离范围大)的使用已经标准化,适于分离200bp-50kb 分子,水平方式电泳。10000kb 的DNA 可采用脉冲电场凝胶电泳(PFGE) 。
  • 用聚丙烯酰胺(分离能力好)来分离小的DNA 片段, 5bp-500bp, 通常制备成垂直式凝胶。碱性琼脂糖凝胶用来水解DNA 和分析单个DNA 链。使用碱性琼脂糖凝胶的原因通常是想查看cDNA 合成过程中第一步由逆转录合成的第一和第二条DNA 链的大小。往热的琼脂糖中加入碱液会水解琼脂糖,所以先以中性溶液制成胶,再在电泳前用新鲜配制的碱性电泳缓冲液平衡凝胶。
  • 经化学修饰的低熔点琼脂糖在较低温度下融化(30’C 成胶, 65’C 融化) 。分辨力好于普通琼脂糖, 但不及聚丙烯酰胺。在冷库中跑电泳以防止琼脂糖凝胶的融解。低熔点琼脂糖很有用,因为有很多种方法从低熔点琼脂糖中回收DNA。
  • 采用合适的琼脂糖浓度。见表2

表2 DNA 电泳所采用的胶浓度

种类 成分 分离范围
A 琼脂糖(%) 线性DNA 分子的有效分离范围(kb)
  0. 3 60~5
  0 .6 20 ~1
  0.7 10~0.8
  0 .9 7 ~0.5
  1.2 6~ 0.4
  1.5 4~ 0.2
  2 .0 3~ 0.1
B 丙烯酰胺(% ) 有效分离范围( 核昔酸对)
  3. 5 100 ~ 1000
  5.0 80 ~ 500
  8 .0 60 ~ 400
  12 .0 40 ~ 200
  20.0 10 ~ 100

A 选择般能分开你要分析的D N A 大小的琼脂糖浓度。
B 如果你感兴趣的DNA 小于1kb, 可用聚丙烯酰胺凝胶。

缓冲液

  • 制胶和实际电泳采用同种缓冲液。
  • 如果用水代替缓冲液来配胶(这是最常犯的错误之一),胶上几乎没有电导, DNA就会移动得很慢或者根本不移动。这时候需要重新配胶。
  • 最常用于DNA 的缓冲液是TAE (Tris-醋酸- EDTA) 与TBE (Tris硼酸-EDTA),有时候也用TPE 。
  • 用不同缓冲液来制胶、跑胶,结果有所不同。例如,双链线性DNA 片段在TAE 中比TBE 或者TPE 中迁移大约快15% ,而超螺旋DNA 的分辨率在TAE 中较好。
  • 推荐使用TBE 。它具有最强的缓冲容量。
  • 如果忘记在胶中加溴化乙锭,可以加到电泳缓冲液中。

表3 常用电泳缓冲液

缓冲液 工作溶液 高浓度贮液(每升)
Tris-乙酸(TAE) l X: 0.04 mol/L Tris- 乙酸
      0.001 mol/L EDTA
50 X : 242 g Tris 碱
          57.1 ml 冰乙酸
          100 ml 0. 5 mol/L EDTA (pH 8.0)
Tris – 磷酸(TPE) 1 x : 0. 09 mol/L Tris- 磷酸
       0.002 mol/L EDTA
10 X : 108 g Tris 碱
          15 .5 ml 85 %磷酸(1.679 g/ ml)
           40 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8 .0)
Tris-硐酸a(TBE) 0.5X: 0.045 mol/L Tris -绷酸
         0.001 mol/L EDTA
5 X: 54 g Tris 碱
       27 .5 g 硐酸
       20 ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)
b 1 X : 50 mN NaOH
        1 mmol/L EDTA
1 x: 5 ml 10 N NaOH
      2 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)

a 高浓度TBE 长时间储存会产生沉淀。为避免产生沉淀,储存5 X 溶液于玻璃瓶,室温, 丢弃任何有沉淀的批次。TBE 的琼脂糖凝胶电泳最初采用1 X 的工作强度(即1:5 稀释高浓度贮液),但是0.5 x 的工作溶液能提供足够的缓冲能力。现在几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以1:10 稀释贮液来进行。TBE 的聚丙稀酰胺凝胶电泳是用1 X 工作强度进行的,是通常琼脂糖凝胶电泳强度的两倍。用于聚丙稀酰胺电泳垂直槽的缓冲液的贮备液很小,而穿过其中的电流量很大。需要1 X TBE 来提供足够的缓冲能力。
b 碱性电泳缓冲液应该新鲜配制。

电源

  • 电压的使用。随着电压的增大,琼脂糖凝胶的分辨有效范围减小。为获得大于2kb的DNA 片段的最佳分辨率,以5V/cm 或者更低的电压进行电泳(两个电极之间的距离,cm) 。5-10 V/cm 可适用于大多数的胶。对一些缓冲液来说, 100 V 大约是50 mA 。
  • 如果电泳过夜,总电压可以是20-25 V 。可以在第二天早上调高电压。
  • 采用稳功率而不是稳压或者稳流可以防止大的电压峰或者产生过热。
  • 以比普通胶慢得多的速度电泳低熔点胶,避免产热。

染色

  • 胶融化之后加入溴化乙锭。每10 ml 琼脂糖溶液加1 μI 10 mg/ml 的溴化乙锭。
  • 并不一定要往缓冲液中加溴化乙锭,可以在电泳后染色,胶体中的溴化乙锭已足够看到大多数条带。

分析

  • 胶中的DNA 可以通过紫外透视灯观察。
  • 戴手套,把胶平放在塑料薄膜上。可以用一个托架或者盘子来移取胶/塑料薄膜,但是托盘将会吸收过多的紫外线,可能看不到染色较浅的条带。
  • 没有经RNA 酶处理的DNA 胶经常可以看到在胶的底部类似扩散条带的tRNA 。
  • 为什么会有这么多的DNA 条带?即未被酶切的质粒DNA 可能在胶上呈现不止一条。

因为超螺旋环形(未被酶切) 、带切口环形(部分酶切)以及线性(完全酶切) DN在胶上以不同速度迁移,因此一个未完全酶切的DNA 可能显示三条不同的条带。

  • 很难预测哪一条带是哪一个DNA, 因为琼脂糖浓度、电流强度与缓冲液类型都有一定影响,但是一般来讲,超螺旋DNA 像一颗致密子弹一样穿过凝胶,跑得最快,线性及切口DNA 紧随其后。

制胶

琼脂糖凝胶

  • DNA 胶现配现用。事先配制的胶可以储存在电泳缓冲液中或者包在塑料薄膜中, 置于冰箱过夜。
  • 利用稀释后的10X 贮液和琼脂糖来制胶。在三角烧瓶中配制所需的量,或者在玻璃瓶中配制足以制成几块的胶。琼脂糖会固化,但是可以在微波炉中重新融化。储存琼脂糖/缓冲液"溶液"于室温。
  • 琼脂糖有几个级别。越纯(越昂贵)污染的蛋白质越少,盐类与其他多糖等污染物也越少。也有适于分离不同大小核昔酸的琼脂糖。如果需要回收DNA, 使用你能承受的最贵的琼脂糖,因为污染物可能抑制酶活性,成为成功克隆的主要障碍。

微波炉加热

  1. 把盖子松松地放在瓶子上,必须能让空气流出,否则瓶子有可能爆炸。如用的是烧瓶,用大一点的,减少暴沸的可能。你可以让口开着或者用塑料膜松松地扎在开口上,不要用铝箔!
  2. 把微波炉调到高温。新鲜配制的琼脂糖比固化的琼脂糖需要更长的加热时间。100 ml 可能需要3~5mm,更多的话大约6-l0min 。
  3. 1 min 后,停掉微波炉,戴着手套抓住瓶子,摇转瓶子及其内容物。混合均匀的东西加热得更快更平稳。
  4. 把瓶子放回微波炉中再加热。1 min 后停止,摇匀。
  5. 再把瓶子放回微波炉加热,直到即将沸腾。
  6. 用夹子或者耐热手套取出瓶子。
  7. 待琼脂糖冷却,直到能用手触摸。倒胶之前摇匀。如果发现部分琼脂糖已经开始固化,用微波炉稍稍加热一下。

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