贴壁细胞的分瓶操作步骤

1.从细胞单层吸出培养基。
2. 缓慢加入37’C 温浴的PBS 或不含血清的培养基,让培养基沿容器壁流下,注意不要滴在细胞上,以免冲掉附着不牢的细胞。
3. 再吸出PBS 或培养基。
4. 加入含0.25 %胰蛋白酶的PBS, 加入蜇以刚刚没过细胞为宜。
5. 立即吸去胰蛋白酶,停留在细胞上的时间为10 ~ 30s(可以用不含血清的旧培养基多洗细胞几次,以除掉痕量的血清,血清的存在会抑制胰蛋白酶的活性)
6. 室温放置5 – 15 min, 每隔几分钟观察容器晃动时单层细胞是否产生滑动。如果是,可以进行下一步实验,如果不是,可以37°C 保温5 min 。
7. 加入与开始时等体积的新鲜培养基,并吹打细胞使细胞分散,在倒置显微镜下确认得到的是游离的单个悬浮细胞。
8. 吸出1 ml 细胞悬浮液至微型离心管中。
9. 对细胞进行计数。
10. 计算出推荐培养浓度的稀释倍数。
11. 吸出适量的细胞至新培养瓶中。
12. 加入适量3 7°C 的新培养基。
13. 轻轻晃动培养瓶,使细胞均匀分散在表面。
14. 把细胞放入培养箱,拧松盖子。
(tip: 如果你使用100 cm 的培养皿,注意区分组织培养皿和细菌培养皿,细胞是不能附着在未经处理的细菌培养皿上。)
eg: 细胞计数得到1.0 X 106 细胞/ mL, 而种子液浓度为105 细胞/ ml, 最终细胞液的体积为10 ml, 那么原液就必须稀释10 倍,也就是1 ml 原液加入到9ml 的新培养基中。

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