蛋白质浓度的测定

通常用的蛋白质浓度测定方法是Bradford 、BCA 以及在280 nm 处的光吸收。实验室倾向于选择一些特定的方法,在订购新的试剂前先试用实验室的常规方法。Brad ford法是最好的一种可以用来满足所有目的的方法。

  • 不能直接用一种方法的结果与另一种方法进行比较,必须相对浓度来比较,例如,用Bradford 法测量到的牛血清清蛋白的量比其称量的值高两倍。
  • 蛋白质样品的特点决定选择何种测量方法。如果知道纯化的蛋白质中没有色氨酸,就不要依赖280nm的光吸收值。如果蛋白质样品中有去污剂,就必须选择一种对去垢剂不敏感的方法,或者去除去污剂。
  • 用任何一种方法测量未知样品都要依据标准曲线,而且每次测量时都一样。如果要知道相对蛋白质的浓度,任何纯化的蛋白质都必须选择一条参考的曲线。牛血清清蛋自(BSA) 和lgG 是通常用的参照蛋白质,除非要测量抗体,一般都使用BSA 。

BCA

工作原理:将硫酸铜加到BCA (bicinchonic acid) 的碱性溶液中,产生一种苹果绿颜色混合物,当溶液中加入蛋白质样品时, Cu2与蛋白样品中的肽键相互作用转变成Cu+ ,混合物的颜色转变成紫色,在562 nm下有最大吸收值。

  • 优点:快速、灵敏、准确。
  • 缺点:受到去污剂和有机溶剂的影响,有时间依赖性,颜色会在24 小时发生变化。

Bradford

工作原理:染料考马斯亮兰G250 在pH<l 时呈红棕色,与蛋白质结合后引起pKa值的变化,颜色就会变蓝,蓝色强度可以在595 nm 测量。

  • 优点:快速、灵敏、准确、没有时间依赖性。
  • 缺点:去污剂的浓度不能超过0.2% ,否则会干扰测量的结果。

280 nm 光吸收值

工作原理:芳香族氨基酸,尤其是色氨酸,在280nm有强烈的光吸收。所有的蛋白质都有芳香族氨基酸(或者紫外吸收因子),在280nm有独特的消光系数。

  • 优点:快速,样品不会受到干扰。
  • 缺点:没有其他方法准确。

双缩脲法(Biuret)

工作原理:测量肽键,在540nm测定OD值。

  • 优点:快速,由于盐浓度的干扰比Bradford 法小,可用于追踪蛋白质分离过程。
  • 缺点:低浓度时测量不准确。

 Lowry (Folin-Ciocalteu) 法

工作原理:与BCA 法类似, 在750nm测定OD 值。

  • 优点:需要很少的物质。
  • 缺点:取决于蛋白质样品中酪氨酸的存在。

 

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