2022年 1月 28日, 星期五
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聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项

  • 聚丙烯酰胺凝胶必须由丙烯酰胺单体、聚合起始物、催化剂以及合适的盐及缓冲液的混合物聚合起来。
  • 丙烯酰胺与BIS (N, N’ – 亚甲双丙烯酰胺)是形成胶基质的单体。
  • 过硫酸铵启动胶的聚合过程。胶的配方要求10% 以水配制的过硫酸铵溶液。大多数资料显示需要现配现用。但是,10 %溶液可以在4℃放置数周而没有明显的活性丢失。最多配制10 ml, 当胶不能聚合时丢弃。

温馨提示:丙烯酰胺的百分比在测序胶和蛋白质胶中是不一样的。如果使用预制的丙烯酰胺:BIS 溶液,确保拿对瓶子。

  • TEMED (N, N, N’, N’ -四甲基乙二胺)是催化剂,装在棕色瓶中,置于冰箱。在即将倒胶之前添加。
  • 聚丙烯酰胺测序胶加有胶缓冲液(TBE) 与尿素。尿素是变性剂,使DNA 反应中发夹环不易形成。
  • 聚丙烯酰胺电泳所用的玻璃板在每次电泳之前及之后都应洗净。电泳之后,用软刷子和布在热肥皂水中清洗,再用蒸馏水淋洗,竖立待干。
  • 水分及灰尘会导致带空洞的聚合物。电泳之前,用玻璃清洁剂清洗玻璃板,用软刷擦拭。蒸馏水淋洗,再用擦拭纸彻底擦干。用纸擦拭之前先用70% 乙醇冲洗有助于清洁,加速干燥。依次加样丙烯酰胺: BIS 、水、缓冲液、过硫酸铵、TEMED。混摇均匀,立即倾倒。
  • 聚丙烯酰胺聚合前并不一定要脱气。(丙烯酰胺过去放置于真空中以除去气泡,因为氧气抑制聚合。)

水平胶点样小窍门。

组装胶盒

  • 放一张黑色纸于胶盒下方,黑色背景使点样孔看得更清楚。
  • 胶槽倒满缓冲液,刚好盖过胶体。
  • 如果边上有灯,打开灯,让光直照胶体。把样品吸入移液器。
  • 使用自动移液器。
  • 插在10-200μ1 移液器上的枪头可用于大多数点样孔。对于非常小的(小于10μ1) 点样孔,用测序胶所用的长移液头比较方便。
  • 将移液头刚好浸入样品,缓慢地吸入移液头。样品可能会因甘油而显黏稠,快速抽吸可能会把气泡吸入移液头。
  • 样品吸入移液头之后,将移液头轻轻靠在管子边上,或者擦拭纸吸走移液头外边的液滴。注意别吸走样品。

将样品点到样品孔中

  • 移液器上保持一点点压力,使样品略微溢出移液头。
  • 把移液头插进缓冲液,略高于点样孔,保持正压。移液头的尖端部分可以伸进点祥孔。
  • 缓慢而稳定地把样品打出去。移液头尖处于点样孔上方,样品会沉入孔中。让样品下沉充满样品孔,而不是推入。
  • 一旦最后一滴样品打出移液头,将移液器推到第二档,缓慢地抬高移液器,移出缓冲液外

如何进行垂直胶的点祥?

  • 垂直胶的点样孔形成于两块玻璃板之间。在非常薄的胶中,移液器移液头甚至不能插入到两块玻璃板之间。注意甘油!把移液头置于样品孔上方,样品会沉入到孔中。
  • 点样之前,一定要把垂直型聚丙烯酰凝胶的点样孔冲洗干净。冲走未聚合的丙烯酰胺和样品孔底部可能出现的水,水可以使样品孔明显变小。用25ml 或者50ml 注射针筒和18 号针头。抽入电泳缓冲液,小心地冲洗样品孔中的水。
  • 可能很难看清样品孔,但是点一个样之后,其余的就变得容易了。如果有多余的孔,可以用样品缓冲液与溴酚蓝试验。

 

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