细胞的冷冻和储存

细胞生长时的表型会发生改变或漂变,所以细胞必须计数,计数后应马上冻存。

冷冻细胞前

  • 检查冷冻细胞所需试剂和器具是否备齐。
  • 确认有无菌的可用于冷冻的冻存管 。
  • 确认液氮罐里是否有冻存细胞的位置。

冷冻细胞

  • 将培养基中的细胞培养至对数生长期。
  • 进行活细胞计数,不要冻存死细胞比例高达20%以上的细胞。
  • 决定冻存量,安排需要几个冻存管。

冻存细胞在融化时要稀释10 倍,而稀释后的液体是5X种子液。

例如:如果种子液的密度为5.0 X 105 个/ ml, 那么融化后重新悬浮细胞时细胞的密度为2. 5 X 106 个/ ml, 所以冻存细胞时的细胞密度为2.5 X 107 个/ ml 。

  • 准备好冷冻培养基, 分装成1 ml, 冻存培养基通常包括一般培养基、10%~20%血清、5%~10%的甘油或二甲基亚砜。如果你不清楚用什么,那么就使用20%的血清和10%的二甲基亚砜。
  • 在冷冻培养基中用移液管小心吹打粒状沉淀。
  • 每个冻存管中分装1 ml 冻存培养基,放置在冰上操作。
  • 把冻存管放入冻存盒中,做好标记,放入-60C 或更低温度的冰箱,放置16~24 小时。
  • 倒些液氮至冰盒内,把细胞从冰箱转移到液氮罐之间要把细胞放在这样的冰盒内。如果没有现成的液氮,可以把细胞放在干冰上。
  • 将细胞放置在合适的位置,立即做好记录。

液氮的使用

  • 细胞常常保存在液氮罐或是液氮制冷柜中,但是要每隔几个星期补充液氮
  • 自动填充液氮的罐子,必须定期检查,以保证管道的畅通以及液氮罐没有空掉。
  • 在操作液氮罐内容器时要戴好厚手套,否则会冻伤手臂。
  • 从液氮罐内拿出细胞时至少也应戴上乳胶手套
  • 不要在液氮罐内悬吊物品,也不要吸入气化后的液氮,用手挥开液氮后,就能看见液面了。
  • 戴好保护眼睛的眼罩,以免操作冻存管时,冻存管爆炸溅伤眼睛。
  • 决不能把没有拧紧的管子放入液氮中,而且要提前找负责液氮罐管理的人员确定位置,不要乱放。
  • 不要关闭警报,定期检查。
  • 如果听到了液氮罐的报警声,立即通知实验室管理人员。如果是周末或凌晨,则先检查确认是否是由于液氮面过低或温度过高引起的报警,再联系负责液氮罐的人员。

 

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