碱-SDS 质粒小量制备

小量制备可以从细菌培养物中抽提和分析,离心机12 或16 管足够一次制备。

一、材料

  • 5 ml 过夜培养细菌培养物。使用LB培养基加入合适的抗生素培养单克隆菌体,37’C 振荡培养
  • 灭菌的微桩离心管
  • 溶液I (裂解缓冲液, 25 mmol/L Tr的HCI pH8.0, 50 mmol/L葡萄糖, 10 mmol/LEDTA) ,冰上预冷
  • 溶液II (变性缓冲液, 0.2 N NaOH, 1.0 % SOS) ,现配现用,室温保存
  • 溶液III (复性缓冲液, 5 mol/L KAc 。制备方法:配制120 ml KAc 再加入23 ml 冰醋酸和57 ml 水,总体积为200 ml ) 冰上预冷
  • TE
  • 70% 和100% 乙醇
  • RNase A (无DNase) ,配成2 mg/ml 溶液,分装并保存于- 20’C 。可以按程序制备RNase A (无DNase) ,也可以直接购买

二、步骤

  1. 加入1.5 ml 培养物于离心管中。
  2. 10000 g 离心2 min, 低温离心更佳,弃尽上清。
  3. 将菌体重悬于100 μl 预冷的溶液I, 振荡2 min 。
  4. 将离心管于室温下放置5min, 细菌将会裂解而释放DNA。
  5. 加入200 μI 溶液II上下颠倒离心管5s以混合,振荡会损伤DNA 。
  6. 冰浴5 min 。
  7. 加入溶液III并颠倒离心管20 s以混匀。
  8. 冰浴5 min, 质粒DNA 将被选择性的复性。
  9. 12000g 离心5 min 。
  10. 用移液头将上清转移至另一个离心管。
  11. 加入5μI 2 mg/ml RNase A (无DNase), 37℃温育5min 。
  12. 加入450 μI 酚-氯仿抽提RNase A 和蛋白质。
  13. 用氯仿抽提。
  14. 加入1 ml 预冷的乙醇并于-80’C 沉淀20 min 。
  15. 吸去或倒掉上清。
  16. 用70% 乙醇洗涤沉淀,离心1 min, 吸去上清。
  17. 于真空中干燥5 min,也可将离心管倒置于纸巾上吸干并干燥30 min 。
  18. 用25 μI TE 重悬沉淀,取2~4 μl 电泳检测并将余下DNA 于-20’C 保存。
图一 a. 两根管子应该底部相靠强烈振荡。
b 如果管子数目超过两个,用一个多管的蜗旋器或者用一个标准的蜗旋器再加上一个可以放扯多管的接头。

推荐

抗体的使用以及储存方式

一、什么是抗体 抗体是一些淋巴 …

发表评论

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注