2022年 1月 28日, 星期五
新闻

如何分离成纤维细胞?

下述的通用操作方案适用于小鼠、大鼠、仓鼠和鸡胚胎。选择大约一半足孕时间的胚胎最好,10 ~ 13 天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞,成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。

  • 胚胎的分离

适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)

  1. 采用认可的方案处死啮齿动物
  2. 立即在无菌超净台内用70%乙醇擦洗整个动物。若可能,置紫外灯下照射5分钟
  3. 用无齿的摄子和剪子在前腿下作一腹部水平切口,用无菌摄子将皮肤扯向后腿
  4. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部,取出含有胚胎的子宫,置于无团的培养皿上
  5. 剔除胚胎周围的包膜,将胚胎放于无菌的含有无菌PBS 的烧瓶中
  6. 漂洗胚胎,去掉PBS,继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止

适用鸡胚胎

  1. 用70 %乙醇擦洗鸡蛋壳
  2. 用无菌剪刀轻敲鸡蛋的圆端,轻轻去除蛋壳露出气囊
  3. 用无菌镊子去除覆盖于绒毛尿囊上的白膜
  4. 剪开包膜,用弯镊夹住胚胎颈部取出胚胎
  5. 弃头部,将无头的胚胎置于广口烧杯中,用PBS漂洗
  • 将6~8 个胚胎转移至一个小的无菌广口烧杯中,用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎,用PBS 漂洗
  • 在无菌状态下,将绞碎的胚胎转移于-500ml 的无菌的有搅拌棒的烧杯中加入200 ~ 300ml 用HBSS 配制的0.25 %的无菌胰蛋白酶( GIBCO/BRL)
  • 在温暖的环境中或置于37℃ 培养箱中轻轻搅动15 分钟
  • 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降,将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌大容积的离心管中,该管内按照每10ml 上清加人1mI 牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶
  • 加人新鲜胰蛋白酶溶液于含有残留未消化组织块的500ml 烧杯中。重复步骤4 和5
  • 离心混合的细胞悬液, 1200r/min, 5 分钟,弃上清。
  • 用新鲜的无菌PBS 重悬沉淀的细胞,按步骤7 再次离心
  • 用PBS 反复洗涤细胞直至上清清亮为止
  • 用含有10% 牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素)的DMEM (GIBCO/BRL) 10ml 再悬沉淀,并使终体积为l00ml
  • 让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降
  • 为确定现有细胞浓度,加入0.2ml 细胞悬液于1. 8ml  1%醋酸溶液中以裂解红细胞,用血细胞计数器进行细胞计数
  • 按每10-mm 平皿 l x107至4 X 107细胞的数量接种于l0ml 组织培养液中,在饱和湿度的37℃ CO2 培养箱中孵育直至细胞铺满
  • 当细胞长满后,去除培养液,用I0%的温暖的Versene(用PBS 配制的0.53mmol .lEDTA, GIBCO/BRL)洗涤细胞层2 次
  • 弃Versene,加入相同体积的温暖0.05% 胰蛋白酶-EDTA (GIBCO/BRL)
  • 37℃孵育 5 分钟
  • 用无菌吸管轻轻吹散细胞,并转移至含l ~ 2ml 血清的无菌管
  • 离心: l200r/min. 5 分钟,弃上清
  • 再悬沉淀于5ml 培养液中,另加人15ml 培养液,分装于 2 个I00-mm平皿中
  • 置37℃ 饱和渐度的CO2培养箱中培养细胞,直至细胞长满,继续步骤14 ~ 20以传代细胞

推荐

siRNA答疑专题总结(上)

Q1:如果慢病毒载体中没有抗性 …

发表评论

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注