英格恩技术博客 专注转染等实验

western-blot实验步骤

Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。可按照以下步骤操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)
使用细胞裂解液,对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶(分离胶及浓缩胶)可以参考一些文献资料进行配制

(2) 样品处理

   在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制, 100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。

(3) 上样与电泳
(1)冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准。
(2)电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置 或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可以设置在120V左右。
(3)为了电泳方便起见,也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式,通常把电压设置在 100V,然后设定定时时间为90-120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适 当分离后即可停止电泳。

3. 转膜(Transfer)
(1)我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用,但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置,可以设定转膜电流为300-400mA,转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大, 需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。

(2)在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春 红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色,以观察蛋白的残留情况。

4. 封闭(Blocking)

(1)转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。

(2)用微型台式真空泵吸尽洗涤液,加入Western封闭液,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体,可以在 4℃ 封闭过夜。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

(1)参考一抗的说明书,按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。

(2)用微型台式真空泵吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果 不佳,可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。

(3)回收一抗。加入Western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

(1) 参考二抗的说明书,按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。

(2)用微型台式真空泵吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

(3)回收二抗。加入Western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5-10分钟。共洗涤 3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

7. 蛋白检测(Detection of proteins)

(1) 参考相关说明书,可使用英格恩的Enlight等超敏ECL发光液来检测蛋白。
(2)洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机,可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。

8. 膜的重复利用(Membrane recovery)

如果蛋白样品非常宝贵,可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜,以重复利用蛋白膜

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