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细胞周期与细胞凋亡分析

      CCAA试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是基于PI 染色(Propidium staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的试剂盒。 下面以engreen的CCAA试剂盒为例,说明一下检测方法。

1.收集并调整细胞浓度为1×106/ml,取1ml单细胞悬液进行后续操作。
1)贴壁细胞:小心吸除细胞培养液,用胰酶消化细胞,制备单细胞悬液。1000g离心3-5分钟,沉淀细胞。加入约1ml预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,可以残留约50μl左右的PBS,以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。
2)悬浮细胞:1000g离心3-5分钟,沉淀细胞。加入约1 ml预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,可以残留约50μl左右的PBS,以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。
3)组织细胞:将组织块用剪刀剪成尽量小的小块后,用0.25%的胰酶消化0.5-1小时,经过200-400目筛网过滤得到单细胞悬液。1000g离心3-5分钟,沉淀细胞。加入约1 ml预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞。如组织难以消化,可加入适量胶原酶。
2.细胞固定:用预冷的75%乙醇4℃固定1 小时至过夜。固定时,在振荡器上轻轻振荡细胞,并缓慢滴加75%乙醇,直接加入会导致细胞团聚的现象,很难重悬成单细胞。或者先用冷PBS充分悬浮细胞,之后缓慢加入无水乙醇,使终浓度为70-75%。
3.去除固定液:离心沉淀细胞,小心吸除上清,用冷PBS 洗涤细胞,再离心。重复几次以去除固定液。可以残留约50微升左右的PBS,以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。
4.加入500ul的CCAA溶液(PI染液)(engreen),轻轻混匀后4℃避光孵育30分钟。
5.上机检测,记录激发波长488nm处红色荧光,进行分析。

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