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siRNA转染实验的几点建议

为了达到高的转染效率,在转染实验过程中,需要注意以下几点:
1.纯化siRNA
siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。
2.避免RNA酶污染
微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等,因此保证实验中的每个环节不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。
4.选择合适的转染试剂
针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同,选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。如engreen的Entranster-R4000,专门针对siRNA等RNA转染。
5.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件
对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞(同样适合实验靶siRNA),转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。
6.通过标记siRNA来优化实验
荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。

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