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western-blot实验中ECL发光检测操作步骤

ECL Western特异发光检测试剂盒用于辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白或核酸检测。下面以engreen的超敏型ECL发光液Enlight-Plus为例,说一下检测实验步骤。

1. 常规电泳、转膜、HRP 标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。以下操作在室温进行。
注意:Enlight-Plus 推荐的抗体稀释度为:

储存液浓度为1mg/ml 的一抗推荐稀释度  储存液浓度为1mg/ml 的二抗推荐稀释度
1:1000-1:5000 或 0.2-1.0μg/ml 1:2000-1:10,000 或10-50ug/ml

2.新鲜配制发光工作液。将BufferA 和Buffer B 按1:1 比率混合,制成发光工作液(每1cm2膜需要0.125ml 发光工作液)。转移到清洁的塑料小盒中。

3. 用镊子将漂洗过的膜取出,将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的洗液,但勿使膜完全干燥。将膜转移至有发光工作液的塑料小盒中,使其完全浸泡,轻轻摇晃,室温孵育几十秒到1 分钟。

4. 用镊子将膜夹起5-10 秒,并将膜的下缘与滤纸轻轻接触以除去膜上多余的发光液,迅速将膜完全包裹于洁净保鲜膜内,去除气泡和褶皱,蛋白面朝上固定于X 片暗盒内。

5. 在黑暗中一次重叠放入3 张X 光胶片,30 分钟或更长时间后全部取出显影。

6. 对同一张膜进行多次蛋白杂交:用PBST 或TBST 洗涤掉发光液(10min×3 次),然后从开始一抗杂交即可。

Western-blot中ECL发光液的选择很重要,Enlight-Plus检测级别可达pg级,发光时间长,背景低,得到的图像很漂亮,非常有利于实验的进行。

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