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siRNA转染常见问题及解决方案

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1. RNA与转染试剂比例不佳
由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。

RNA浓度和转染试剂量的优化(24well)

1 2 3 4
RNA工作浓度 25nM 50nM 100nM 150nM
每孔RNA的量(pmol) 0.17μg(12.5pmol) 0.33μg(25pmol) 0.67μg(50pmol) 1μg(75pmol)
每孔转染试剂量 0.25μl 0.5μl 1μl 1.5μl 

 

2. 细胞密度不佳
调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调,但未成功转染的细胞却不受影响,这时转染效率和总的细胞数量就很重要,一般细胞数量较少时转染效率高。由于siRNA沉默时效性的影响,转染后48小时才能进行进行qRT-PCR检测,转染后48-72小时才能进行蛋白检测。如果转染时铺板密度较高,细胞一方面转染效果不理想,直接影响沉默效果和数据可靠性,另一方面,48小时甚至更长时间后,沉默检测最佳点时,过于密集的细胞将影响细胞状态,从而影响实验结果。

3. RNA效率不高
选择最优RNA,并采用已知高效的RNA做对照。siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA,siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。siRNA的工作浓度和siRNA的设计、细胞种类、目标基因有关。建议一定进行相关的预实验优化各条件。

4. RNA酶污染
建议无RNA酶和内毒素的吸头、离心管和溶液等材料和实验器具。

5. 转染后培养时间不够
在mRNA水平可以到48小时以后验证结果,在蛋白水平可以到72小时后验证结果。siRNA的沉默效果是有时效性的,在最佳的时间点观察,会得到更加明显的沉默效果,这个时间点的确定不能以同一株细胞转染DNA的经验确定,因为一个是消耗mRNA,一个是产生mRNA。对转染siRNA,在核酸水平,转染后8-48小时,即可观察到mRNA水平的逐步下降,一般来说,转染后48小时进行qRT-PCR检测通常会得到漂亮的结果。

6. 培养基毒性
采用含10-20%血清的全培养基。使用脂质体等转染试剂时,由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞,引发细胞毒性,导致转染效率降低,故不能有血清转染。EntransterTM只浓缩包裹核酸不会将血清带入细胞,所以可以有血清转染,同时由于血清的存在,有利于细胞的状态维护,故能提高转染效率。

7. 细胞污染
建议彻底清洁所有细胞培养相关用品

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