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免疫共沉淀经验总结分享

免疫共沉淀:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整的细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间结合的保持下来。

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免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术,其基本原理是,在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA),若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”,因为SPA\|Pansobin比较大,这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法,用抗体检测目的蛋白是什么,是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的,符合体内实际情况,得到的蛋白可信度高。

  1. 做免疫共沉淀之前,做好那些预测工作?

免疫共沉淀有两个缺陷:一是目的蛋白和兴趣蛋白的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;二是必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

2.在加抗体之前,在cell lysate中加了protein A/G珠子进行pre-clear,然后才进行共沉淀。但是跑SDS发现,pre-clear珠子出来的条带竟然和免疫共沉淀下来的蛋白条带几乎一样(除了抗体),疑问:怎么没有加抗体也出现这么多非特异性条带?

有带是可能的,毕竟细胞内成份是很复杂的。你在做完pre-clear后,进行IP看阳性与阴性结果是否有差别,这样由于抗体和特异性结合可以排除非特异性干扰。

 

3.裂解液中含有1%的SDS,会影响核蛋白抽提物中蛋白质-蛋白质相互作用吗?

建议做免疫共沉淀的亲,在蛋白提取的裂解液中就不要用阴离子界面活性剂SDS,而应该用非离子界面活性剂Triton X-100。SDS属于离子变性剂,理论上是可能对蛋白的相互作用产生影响的。

4.免疫共沉淀后蛋白质的洗脱方法?

免疫共沉淀以后,蛋白质抗体复合物结合在磁珠上,离心收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,用PBS或RIPA buffer洗3遍后,蛋白电泳上样前,将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

5.IP下来的抗原量少怎么办?

鉴定抗原过程中,用IP-Western能够检测到抗原,但是用考马斯亮兰染膜却看不到蛋白条带,原因可能是因为IP下来的抗原量少。可以考虑富集原总蛋白浓度,提高IP下来的抗原量

 

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