英格恩技术博客 专注转染等实验

PCR实验步骤及常见问题汇总

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。

q

一、    聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)

PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成:
①     模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②     模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③     引物的延伸:DNA模板–引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
④     重复循环变性–退火–延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间,是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3’端开始延伸,其5’端是固定的,3’端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”。进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时,由于新链模板的5’端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

试剂
DNA模板,与特定DNA模板结合的引物,去离子水,商业化的DNA聚合酶以及缓冲液,dNTP, MgSO4(可选)和DMSO(可选)

PCR反应开始前的准备工作
PCR反应开始前,你需要准备好DNA模板(基因组DNA或者反转录制备的cDNA),特异性的引物(手动设计或利用软件设计)并选择合适的商业化DNA聚合酶(根据实验的目的不同做出决定)。

1.    DNA聚合酶的选择。市面上有多种DNA聚合酶可供选择,他们的特性也各有不同。因此你需要选择最适合自己实验需要的产品。通常我们将DNA聚合酶分为高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到没有任何突变的PCR产物,那应当选择高保真聚合酶。若你只是希望判断特异性序列的存在与否,那普通的Taq聚合酶已经足够。另外要注意的一点是,进行T载体连接的时候,要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有A末端的,因此你在T载体连接之前需要进行加A反应。或者直接选用普通的Taq聚合酶。
2.    引物。引物特异性会影响到PCR反应成功的可能性,好的引物设计对PCR成功至关重要。设计引物时,有以下几条原则需要谨慎考虑:
1.    引物长度。通常PCR引物长度在18-22个碱基之间。这对引物的特异性以及退火温度而言均已足够。
2.    解链温度Tm。Tm值的定义是使得一半双链DNA解螺旋成为单链DNA的温度。引物的Tm值通常要在52-58度之间。
3.    GC含量。最适合的GC含量为40-60%。
就目前而言很多软件都可以用来设计引物,如primer5和Oligo。通常这些软件设计得到的引物均可以满足需要。

步骤
准备好各种试剂和PCR仪,就可以开始PCR实验:将各种试剂混合并按照说明书设置PCR反应。一般PCR循环如下:

1. 起始步骤:这对于热启动PCR而言是必须的,将反应混合液加热至94-98度以激活DNA聚合酶。这一步的时间取决于所选用的DNA聚合酶。
2.    变性步骤:DNA本身是双链结构,而DNA扩增需要引物与单链DNA模板相结合。在这一步,反应混合液被加热至94-98度保持20-30秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链DNA。这是PCR循环中的第一步。
3.    退火步骤:变性之后,DNA模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与DNA模板互补,当反应温度降至50-65度时,引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的Tm值,通常比引物Tm值低3-5度。这一步通常维持20-40秒,而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始DNA合成。
4.    延伸步骤:在这一步,DNA聚合酶开始DNA合成,因此这一步的温度选取的是DNA聚合酶的最优温度。通常我们选用72度,但某些DNA聚合酶的最适温度是68度。这一步与体内的DNA复制很相似:DNA聚合酶按照碱基互补规律将dNTPs加到引物的3’末端最终得到新的DNA双链片段。延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能够合成1kb长度的DNA。
5.    第2步至第4步称为一个循环:每次循环之后DNA的量均是前一次的两倍。通常一次PCR反应进行30-35个循环。在前几轮的PCR循环过程中PCR产物的量以指数速率增长,但是到了反应后期随着dNTPs和引物的量的减少以及DNA聚合酶的失活,反应速率逐渐下降,因此PCR反应的产量也受到了限制。
6.    最后的延伸步骤:当30-35个循环结束后,我们通常会以68-74度延伸5-10分钟,这是希望使反应体系中残留的单链DNA全部反应完毕。
7.    维持时间:通常我们设置4-10度为反应后PCR产物的保存温度。

二、PCR常见问题汇总

1. 无扩增条带
(1)酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活,往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
(2)模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。
(3)变性温度是否准确:PCR仪指示温度与实际温度是否相符,过高酶在前几个循环就迅速失活;过低则模板变性不彻底。
(4)反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶,应在未加Taq酶以前,将反应体系95℃加热5-10分钟。
(5)引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化,或因储存条件不当而失活。
(6)引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(7)DNA凝胶电泳时加入阳性对照,确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。

2. PCR产物量过少
(1)    退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
(2)    DNA模板量太少。增加DNA模板量。
(3)    PCR循环数不足。增加反应循环数。
(4)    引物量不足。增加体系中引物含量。
(5)    延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
(6)    变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
(7)    DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

a
3.    扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
(1)酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。
(2)dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。
(3)MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。
(4)模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。
(5)引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
(6)循环次数过多;增加模板量减少循环次数至30,缩短退火时间及延伸时间,或改用二种温度的PCR循环。
(7)退火温度过低。
(8)电泳体系有问题:
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大;
②凝胶没有凝固好;
③琼脂糖质量差。
(9)若为PCR试剂盒则可能:
①由于运输储存不当引起试剂盒失效;
②试剂盒本身质量有问题,如引物选择、循环参数等选择不当。
(10)降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

4. 扩增产物出现多条带 (杂带)
(1)引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
(2)循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。
(3)酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。
(4)退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
(5)样品处理不当。
(6)Mg2+浓度偏高,因适当调整Mg2+使用浓度。
(7)若为PCR试剂盒,也可能时试剂盒本身质量有问题。
(8)    复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
(9)    反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
(10)    引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(11)    引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
(12)    模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。
(13)    外源DNA污染。确保操作的洁净。

5.阴性对照出现条带
试剂,枪头,工作台污染。使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。
6.条带大小与理论不符
1)    污染。使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。
2)    模板或引物使用错误。更换引物和模板。
3)    基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。

扫描二维码,随时阅读沟通。

英格恩技术的微信

Check Also

导致western Blot发光(ECL)“背景高”的原因有哪些?

Western Blot发光经 …

发表评论

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注

*