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G418筛选转染克隆的注意事项

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G418作为稳定转染通用的一种筛选方式,在进行筛选前应该要注意几点:

1.    G418的浓度:G418是一种氨基糖苷类似物,它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。因此在筛选过程中G418的浓度将对转染细胞的筛选产生很大的影响。在筛选之前最好进行条件优化确定最佳筛选浓度。尽管文献有报道筛选浓度,最好还是要自己亲自做一下筛选浓度的确定。

2.    细胞状态:细胞状态会影响对药物的敏感性。可以通过常规的培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。每周传代一到两次,稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。不要使细胞保持融合超过24小时。

3.    细胞维护:根据培养基的颜色和细胞生长情况,定期更换新鲜培养基。

4.    其他抗生素的使用:对于稳定转染,不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素,因为这些抗生素是G418抗生素的竞争性抑制剂。在转染培养基中不能使用抗生素,甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样,在转染前也不必润洗细胞。

5.    细胞保存:细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化。如果随时间发现这种变化,一管保存的新鲜的细胞可能会恢复原先的活性。比如,新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率。融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。因此,如果观察到细胞活性降低,可以试着复苏新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。

一、筛选曲线的建立

1. G418的配制:取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml中,加蒸馏水至10ml,过滤除菌,4℃保存;

2. 细胞培养:取待测培养细胞,制备成细胞悬液,按等量接种入多孔培养板中,培养6h左右开始加药;

3. 制备筛选培养基:在100~1000ug/ml范围内确定几个梯度,比如先做个100、400、800、1000ug/ml,按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基;

4. 加G418筛选:吸除培养基,PBS洗涤一次,每孔中加入不同浓度的筛选培养基;

5. 换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况,每隔3~5d更换一次筛选培养基;

6. 确定最佳筛选浓度:在筛选10~14d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。

二、G418筛选转染克隆步骤:

1. 建立筛选曲线,确定最佳筛选浓度;

2. 细胞铺板:转染后24小时将贴壁的细胞传代(传代时,注意通过在显微镜下观察,控制细胞密度,不能使细胞太密集,应该少于生长表面的50%,参考为20%-30%)至15cm培养皿,加入15~20ml培养基(DMEM,含血清)进行培养;

3. 用最佳筛选浓度的G418对细胞进行筛选:铺板完成后,再过24小时,抗性表达,用最佳筛选浓度的G418进行筛选(对于Hela细胞,一般筛选终浓度为800ug/ml)。具体操作是去除旧的培养基,用PBS洗一次,将含有浓度为800ug/ml(以Hela为例)的培养基15~20ml加入培养皿内即可;

4. 换液:每日及时观察细胞,根据培养基的颜色和细胞生长情况,及时更换相同浓度(800ug/ml)的培养基,大概持续筛选一周左右,直至空白对照组(未转染组)细胞死亡大部分(至少30%以上);

5. 撤药维持阶段:待空白组细胞大部分死亡后,将实验组(转染组)进行换液,此时所用培养基含G418的终浓度为200ug/ml(维持浓度),维持生长(若细胞仍有死亡,需要继续降低药的浓度,参考为50-100ug/ml),直至筛选克隆可见为止(大约2~3天);

6. 分离克隆以获得最大数量细胞(提高克隆成活可能性),减少单个克隆受其他细胞污染的机会。具体操作是:a.用PBS洗含有克隆的培养物,圈出欲分离的克隆。从培养皿中除去液体,准备24孔板收集克隆;b.从培养皿中用牙签或者棉棒(经过高压)挑取已分离出的克隆(具体操作是先用棉棒蘸一下胰酶,再蘸一下克隆);c.在24孔板的一个孔中(事先已加入完全培养基,不含G418)剧烈摇动牙签,使细胞沉于孔中,继续挑取下一个克隆;

7. CO2孵箱,温育细胞约两小时;

8. 两小时后,镜检培养皿,确定细胞是否附着。如果已经附着,用新鲜完全培养基(含50ug/ml G418)更换24孔板培养基,除去残留的胰蛋白酶,继续培养直到培养物长满;

9. 一旦小量培养物长满,转接到大的培养皿(通常先是6孔板),用50ug/ml的新鲜完全培养基维持培养,然后与同样类型的其他细胞一样处理即可。

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