2024年 5月 24日, 星期五
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Tag Archives: 转染

慢病毒载体的滴定

一、试剂 完全培养基、DMEM 培养基、胎牛血清(FBS)、慢病毒载体储备液、多聚甲酸( 4%) ( 可选;见步骤15)、青霉素/慢病毒滴定试剂盒链霉素溶液( P/S ) (100 ×)、磷酸盐缓冲盐水( PBS )、聚凝胺(海美溴铵) ( 8mg/mL) 、QuickTiter (慢病毒相关的HIV p24 )、293T 细胞、胰蛋白酶-EDTA ( 0. …

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在哺乳动物细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA 功能

向哺乳动物细胞内转染反义寡核苷酸从而抑制miRNA 功能的具体方法参照本方案。通过检测miRNA 靶蛋白水平或携带miRNA 靶基因的3’端非翻译区( 3UTR ) 报道基因的活性来检测ASO 对于miRNA 的效应。本方案主要针对24 孔板设计,如果用其他多孔板、细胞瓶或不同直径培养皿培养细胞,需根据孔/瓶表面积计算细胞密度和试剂体积 试剂 A …

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如何选择合适的转染方式?

方法 表达 细胞毒性 细胞类型 注释 优势 劣势 瞬时 稳定 脂质体介导方案1 可 可 可变 贴壁细胞,原代细胞系,悬浮培养体系 阳离子脂质与带负电荷的DNA 结合, 有的形成人工膜囊泡(脂质体)。产生的稳定阳离子复合物吸附并融合于带负电荷的细胞膜( Feigner et al. 1987, 1994 ) 免疫原性和细胞毒性低;可使用大质粒, 安全风险低,操 …

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转染实验如何设置对照?

所有的转染实验均应包括对照,以检验各个试剂和制备的质粒DNA , 以及检测将要引入的基因或构建体的毒性。 瞬时表达的对照 阴性对照 在瞬时转染实验中,需要用载体DNA 和/或用于稀释待测质粒或基因的缓冲液转染一两个培养皿的细胞。通常采用鲑鱼精DNA 或用于构建重组体的空载体等其他惰性载体代替待测基因转染贴壁细胞。转染后,培养的细胞不应从培养皿上脱落,外观上也 …

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做慢病毒感染实验前,你需要哪些知识储备?

慢病毒载体的构建: 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成,即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白;载体成分则与包装成分互补,即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转 …

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揭秘RNAi,缔造实验神话

用siRNA进行transient transfection不稳定,几代细胞以后,症状就会消失,所以在转染几天(1-3)后要立刻抽提蛋白,进行分析。 用质粒中的shRNA进行转染,如果质粒含有抗生素位点,可以进行筛选,获得较稳定的细胞株系,但需要时间较长 用病毒中的shRNA进行感染(infection),抗生素筛选后,可以获得很稳定细胞株系。 瞬时RNAi …

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通过乳酸脱氢酶法分析细胞活力

图1 乳酸脱氢酶催化的可逆反应 常用的细胞毒性测定方法的基础是测量受损细胞释放的胞浆酶的活性。乳酸脱氢酶( LDH ) 是一种所有细胞中均存在的稳定的胞浆酶。在不同类型的组织中存在5 种不同的乳酸脱氢酶异构体,它们在数量、特异性和酶作用动力学方面存在差异。但所有不同的酶异构体均催化相同的丙酮酸和乳酸相互转化,伴随着NADH 氧化为NAD+的反应(图1) 。当 …

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在果蝇S2细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA 功能

本方案描述了将ASO 转入果蝇S2 细胞以便抑制miRNA 功能的方法。通过检测miRNA靶蛋白水平或miRNA 靶基因3UTR 报道基因的活性,可以检测ASO 对miRNA 的效应。本方案是针对24 孔板设计的,若用其他多孔板、培养瓶或不同直径培养皿,应根据其表面积计算细胞密度和试剂体积 。 试剂 ASO ( 12.5μmol/L ) 和错配和/或无关对照 …

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