英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 RNA浓度和转染试剂量的优化(24well) 1 2 3 4 RNA工作浓度 25nM 50nM 100nM 150nM 每孔RNA的量(pmol) 0.17μg(12.5pmol) 0.33μ …
阅读更多 »siRNA转染常见问题及解决方案
磷酸钙-DNA共沉淀法的原理和步骤
前些时间有微友在平台上咨询细胞转染的事项，并对一篇博客文章《为什么磷酸钙转染并不稳定？为什么磷酸钙转染并不经济？》比较感兴趣。在这里，对这位微友的疑惑进行更加全方位的了解，在此将磷酸钙转染的原理和步骤和大家分享，以供交流讨论。 核酸以磷酸钙-DNA 共沉淀物的形式出现时，可使 DNA 附在细胞表面，这有利于细胞吞入摄取核酸，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进 …
阅读更多 »细胞转染为什么不能加血清？
看过很多细胞转染的高手，在做真核细胞转染时，都是在把核酸和转染试剂的混合液加入细胞表面以前，将融合的细胞的含血清的培养液弃去，用无血清培养基清晰后再加入混合物，4-6h后再换含血清的培养基。这是为什么呢？为什么这些转染试剂要求不含血清呢？ 传统的转染试剂有一定的细胞毒性，在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养基中添加抗生素。如，阳离子脂质体。带正电的脂 …
阅读更多 »通过alamarBlue 法分析细胞活力
水溶性染料 alamarBlue 已用于体外定量多种类型细胞的活力( Fields and Lancaster 1993; Ahmed et al. 1994 ) 。该试剂极其稳定且无毒，因此可用于长时间连续监测细胞( Ahmed et al. 1994 ) 。基于上述原因， alamarBlue法被认为优于MTT 检测等经典的细胞活力检测方法。在一个比较实 …
阅读更多 »成功转染siRNA的主要关键点有什么？
1.设计合成有效的siRNA RNAi的核心需要siRNA对相应mRNA进行有效的结合和作用。siRNA的设计合成首先很重要，最优的设计可以用最小的工作浓度取得满意的沉默效果，减少副反应的发生。siRNA的设计可以通过检索,优先选用经过验证的siRNA或设计多对siRNA。需要强调的是，需要同时设置阴性对照以排除非特异沉默现象和阳性对照以确认整个实验体系的有 …
阅读更多 »在哺乳动物细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA 功能
向哺乳动物细胞内转染反义寡核苷酸从而抑制miRNA 功能的具体方法参照本方案。通过检测miRNA 靶蛋白水平或携带miRNA 靶基因的3’端非翻译区( 3UTR ) 报道基因的活性来检测ASO 对于miRNA 的效应。本方案主要针对24 孔板设计，如果用其他多孔板、细胞瓶或不同直径培养皿培养细胞，需根据孔／瓶表面积计算细胞密度和试剂体积 试剂 A …
阅读更多 »如何使动物体内病毒感染效率提高20-50倍
由于动物体内环境的复杂性，我们在选择动物体内病毒感染试剂时，会区别于细胞实验。通常为避免动物产生过激的免疫反应或者死亡，这类病毒感染试剂纯度会更高些，并且适配体液环境。因此，争对动物体内病毒感染实验，则需要适配特定的动物体内病毒感染增强试剂。 发表在《aging》上的一篇题为“Ubenimex induces autophagy inhibition and …
阅读更多 »通过转染双链siRNA 在果蝇S2 细胞中进行RNA 干扰
本方案介绍一种通过试剂向果蝇S2 细胞转运siRNA 以触发RNA 干扰的有效方法。本方案适用于24 孔板内培养的细胞。如果使用其他规格的多孔板、培养瓶或者培养皿，需要根据培养孔的表面积换算细胞密度和试剂用量（表1 ) 。 表1 果蝇细胞转染所用细胞， 转染试剂和siRNA （或者ASO) 的体积 培养板或培养皿 24孔 12孔 6孔 6cm 10cm 每孔 …
阅读更多 »高效低毒的RNA转染试剂，收藏～
EntransterTM-R4000是英格恩生物（Engreen Biosystem）最新研发合成的针对siRNA、microRNA、mimic、inhibitor、mRNA和shRNA等RNA的转染试剂。EntransterTM-R4000不仅可以转染小RNA，而且针对mRNA等长链RNA优化。 EntransterTM系列转染试剂的成分和原理 Entr …
阅读更多 »在果蝇S2细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA 功能
本方案描述了将ASO 转入果蝇S2 细胞以便抑制miRNA 功能的方法。通过检测miRNA靶蛋白水平或miRNA 靶基因3UTR 报道基因的活性，可以检测ASO 对miRNA 的效应。本方案是针对24 孔板设计的，若用其他多孔板、培养瓶或不同直径培养皿，应根据其表面积计算细胞密度和试剂体积 。 试剂 ASO （ 12.5μmol/L ) 和错配和/或无关对照 …
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