细胞转染

       siRNA转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；可以选择细胞毒性小的非脂质体类的转染试剂，如Entranster试剂，另外，如果siRNA所靶向的基因对于维持细胞生长是非常重要的，出现细胞死亡 …

microRNA（miRNA）是一种机体内源性表达的单链小分子RNA，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框（open readingframe，ORF），具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中，不编码任何蛋白质，长度仅为20～24nt。成熟的miRNA5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，由具有发夹状结构的约70～90nt的 …

下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下siRNA转染步骤（24孔板） 1.提前1天细胞种植 贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那 …

这种现象可能由以下几个原因引起： 病毒感染对细胞的影响： 病毒感染（例如慢病毒载体的感染）会对细胞造成一定的压力，可能导致细胞的代谢、增殖状态和基因表达发生变化。即使是没有病毒基因组整合的病毒颗粒也可能激活细胞的应激反应、免疫反应，或者影响细胞的健康状态，从而导致细胞更容易受到药物（如嘌呤霉素）的影响并死亡。 病毒颗粒的毒性： 某些病毒载体本身可能具有一定的 …

转染方法：将基因导入真核细胞的方法可分为三类：生化方法转染、物理方法转染、病毒介导的转导。 转染方法的选择取决于下列几个实验要素： ．最终目的是基因表达还是蛋白质生产 ．采用的细胞类型（贴壁细胞或悬浮细胞，适应培养的细胞或原代细胞） ．细胞系抵抗转染压力的能力 ．采用的筛选方法的类型 ．培养条件 ．转染的核酸种类( DNA 、RNA 、siRNA 或寡核菩酸 …

DEAE －葡聚糖介导的转染与磷酸钙共沉淀介导的转染在三个方面有重要的不同。第一，该方法用于克隆基因的瞬时表达，而不是细胞的稳定转化(Gluzman 1981 ) 。第二，该方法对BSC-1 、CV- 1 和COS 等细胞系非常有效，但对许多其他类型的细胞转染效果不理想。第三， DEAE－葡聚糖转染的DNA 用量比磷酸钙共沉淀转染少。采用0.1 ~ 1.0μ …

悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μ …

siRNA转染效率不理想，常见的原因有： 1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率 …

根据描述，您的shRNA已经成功将转录水平（mRNA水平）敲低了90%，但蛋白水平却没有显著变化。这种情况在RNA干扰实验中并不罕见，可能由以下原因导致： 可能原因分析 蛋白半衰期较长： 有些蛋白具有较长的半衰期，即使mRNA水平显著下降，蛋白水平可能仍然稳定。这是因为已有的蛋白质分子不会立即降解，需要更长时间才能逐渐减少。 翻译后调控： 某些蛋白质可能受翻 …

1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …