英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1. 脂质体法。中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。脂质体法始于1987年，此法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。阳离子脂质 …
阅读更多 »siRNA与DNA转染有什么不同？
首先siRNA由于只有二十几个碱基对，相比DNA几千上万对碱基，小了许多。目前大多数转染试剂都针对比较大的质粒DNA，而非小的RNA分子。用于转染DNA的转染试剂和方法并不完全适用于转染siRNA。其次，siRNA转染比DNA转染对转染试剂细胞毒性的要求严格。由于转染试剂对细胞的毒性往往是对众多基因直接地或间接地上调或下调的结果，这对于过量表达的DNA转染来 …
阅读更多 »细胞转染实验的方法都有什么？
1. 电穿孔法。通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。DN被认为是穿过孔扩散到细胞内的。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪。此法每次转染需要更多的细胞和DNA，因为细胞的死亡率 …
阅读更多 »细胞的支原体检测——扫描电子显微镜法
（一）原理 利用电子显微镜的超级放大功能， 直接观察培养细胞中支原体污染情况。 （二）材料与设备 待检测细胞， 0.05％胰蛋白酶／0.02%EDTA 、2.5％的戊二酸、1％饿酸、0.1mol/L磷酸缓冲溶液（ pH7.4 ) ，扫描电镜及相关设备。 （ 三）操作步骤 1. 将待检测细胞传代至贴有盖玻片的培养皿中。2. 37°C , CO2 培养箱中培养2 …
阅读更多 »细胞转染效率的影响因素
1.细胞密度 一般来说，当细胞密度达到60%～80%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。 2.细胞状态 这点非常关键，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。 还有，尽量选择无 …
阅读更多 »转化细胞在软琼脂中的生长
恶性转化的细胞在许多方面不同于其相应的正常细胞，主要不同在于它们失去了接触抑制生长，获得永生性和在动物宿主体中形成肿瘤的能力。软琼脂培养可作为体外检测细胞转化和致瘤性的替代方法。 材料 2% (w/ v) 琼脂 基础营养培养基，如DMEM ，含24. 6 ％和20% (v/ v) 胎牛血清 单细胞悬液 12 孔培养板 15ml 聚碳酸酣锥形离心管 ，灭菌 对 …
阅读更多 »电转染实验过程影响因素
1 电场参数 电场是电转染的重要因素，细胞在电场的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一个适宜的电场强度至关重要。 不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以 …
阅读更多 »siRNA细胞转染操作步骤
下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下siRNA转染步骤（24孔板） 1.提前1天细胞种植 贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那 …
阅读更多 »细胞转染需要注意什么事项
1.细胞密度 一般来说，当细胞密度达到60%～80%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。 2.细胞状态 这点非常关键，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。 还有，尽量选择无支原体污染的 …
阅读更多 »体外培养细胞的一般性质（五）
体外培养细胞传代规范的建立 细胞从原代培养时开始，就要建立细胞传代常规，即最好依据严格的时间表进行传代等操作，这样可以保持和监控细胞的增殖行为。若到了适合的时间，细胞还没有达到足够高的密度（即细胞没有彼此汇合），那么应增加接种密度：相反，若细胞很快彼此汇合，则应降低接种密度。理想的细胞浓度是使细胞每3~4d 更换培养液，每7d 传代。常规传代使细胞可重复标准 …
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