英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现，要弄清楚“背景太高”的原因，先要知道“背景”是什么，“背景”也是发光，影响发光的因素就会影响背景。 影响发光的因素主要有：1.含HRP的抗体；2.发光试剂；3.和发光试剂反应的杂质，如含杂质的膜。这里面，在很短时间内曝光造成的背景多是由于含HRP的抗体的因素造成的，抗体浓度过高，洗涤不充 …
阅读更多 »大肠杆菌转化实验（热击法）
大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。 1原理： 质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。 2器材： 旋 …
阅读更多 »慢病毒感染细胞后，细胞长满48小时是否可以先传代，再等到72小时再喷霉素筛选吗
通常在进行慢病毒感染后，建议遵循以下操作步骤： 感染后观察细胞状态：感染后一般在48-72小时内可以看到较为明显的表达，但是否开始筛选需要看细胞的状态和感染效率。如果细胞长满了，可以考虑先进行传代，以避免细胞过度拥挤影响生长和感染效果。 喷霉素筛选的时机：喷霉素通常在感染后48-72小时开始筛选，但实际开始筛选的时间取决于感染效率和细胞状态。如果细胞感染后状 …
阅读更多 »封闭问题可大可小，千万不能掉以轻心
Western Blot是检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化的首选方法，也是实验室常见的实验方法。 完整的Western实验过程比较长，做一次Western也不容易。有结果当然是好的，没有结果也是常有的事，出现各种烦心结果也是时有发生。其中最常见的一种就数显色后背景高了。背景高，目的蛋白颜色对比不明显，要么看不清，图片展示不理想，更 …
阅读更多 »western-blot实验的影响因素有哪些？
1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这 …
阅读更多 »mRNA的分离
mRNA 在细胞总RNA 中占较小的比例，大量的是核糖体RNA。真核生物的mRNA分离方法利用了大多数mRNA 存在多聚腺苷酸尾巴（有一些mRNA 没有多聚腺苷酸的尾巴）。Poly(A) RNA 可以结合在有多聚寡核苷酸(dT) 的树脂上，在高盐的条件下寡聚胸苷酸－纤维素可以结合PolgA-mRNA, 在低盐的情况下洗脱。这种方法可以批量或者在一个小柱子上操 …
阅读更多 »RNA的提取方法及原理
RNA提取原理 RNA提取时，加氯仿后分三层：水相(含rna,可能还有少量DNA），中间白色薄层（应该是蛋白和DNA），下层有机相（氯仿和蛋白等） 氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DN …
阅读更多 »靶向eIF4G1根除胰腺癌研究
文献标题 Reprograming immunosuppressive microenvironment by eIF4G1 targeting to eradicate pancreatic ductal adenocarcinoma 期刊与影响因子 期刊： Cell Reports Medicine 影响因子：14.3（2024年） 英格恩（Engree …
阅读更多 »单克隆抗体的制备——杂交瘤的建系
在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前，应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量，可以选择其中20 个最佳的候选孔。在检测这20 个孔的培养上清为阳性后，应该将这些孔的细胞进行冻存，同时进行有限稀释。 附加材料 生长的杂交瘤 克隆和扩增用培养基 24 孔板 4ml 有盖试管，无菌 步骤 当96 孔板中生长的杂交瘤长到2 5%~50 ％汇合时（主 …
阅读更多 »问：现在是将构建好的质粒电转入到自制的感受态细胞里，质粒有10000bp，是90μL感受态细胞中加3.5μ质粒。我之前有电转过6000多bp的质粒，过夜培养可以长菌的。但是这个10000bp的质粒过夜培养没有单菌落，延长培养时间后有个别单菌落，但是挑单菌落到LB中并不浑浊。这种情况我是应该调整一下电转程序还是改一下加入质粒的量呢？
以下是详细的优化建议： 优化质粒用量（首要调整）： 问题： 你目前使用的是3.5µL质粒加入90µL感受态细胞。关键在于质粒的浓度（ng/µL），而不是体积。 3.5µL 对于90µL感受态细胞来说体积不小，如果质粒浓度较高，实际DNA量可能大大超过电转最优范围。 原理： 过量的DNA会导致电击时产生过多的热量和离子效应，严重降低转化效率，尤其对大质粒（&g …
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