英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1、样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时 …
阅读更多 »2022的七大热点技术： 靶向基因治疗、空间多组学……
1.完全基因组 在去年5月发表的预印本中，人类共有基因组序列 GRCh38 添加了近 2 亿个新碱基对，并撰写了人类基因组的最后一章。 GRCh38 于 2013 年首次发布，一直是一个有价值的工具，但也存在漏洞。主要是因为测序技术产生的读数准确但较短。它们的长度不足以明确地绘制出高度重复的基因组序列，包括覆盖染色体末端的端粒和在细胞分裂过程中协调新复制的 …
阅读更多 »在果蝇S2细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA 功能
本方案描述了将ASO 转入果蝇S2 细胞以便抑制miRNA 功能的方法。通过检测miRNA靶蛋白水平或miRNA 靶基因3UTR 报道基因的活性，可以检测ASO 对miRNA 的效应。本方案是针对24 孔板设计的，若用其他多孔板、培养瓶或不同直径培养皿，应根据其表面积计算细胞密度和试剂体积 。 试剂 ASO （ 12.5μmol/L ) 和错配和/或无关对照 …
阅读更多 »电穿孔和电融合技术原理及流程
[实验原理] 当细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象称为电穿孔。运用这一技术，许多物质，包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞。作为一种基因转导方法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，它还能作为注射方法（称为电注射），把各种外源物质引入活细胞。与其他常用 …
阅读更多 »DNA 的 PCR 扩增
一、 PCR反应体系的组成 1.PCR扩增缓冲液： 50mM KCl10mM Tris HCl( pH8.0)1.5mM MgCl2 2.寡核苷酸引物：是按已知待扩增的DNA 片段序列进行设计，用 DNA合成仪合成。引物序列应位于DNA片段的保守区，两条引物间应注意不要有 …
阅读更多 »为什么CRISPR没有成为目前基因治疗的首选技术？
CRISPR的热度在分子生物界持续了数年，而2020年的诺贝尔化学奖授予给了两位CRISPR的奠基者，更是将CRISPR的研究热潮推上了顶峰。 CRISPR实际是（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，成簇的有规律的间隔短回文片段）的简称。 1987年，科学家在大肠杆菌中发现了一段“ …
阅读更多 »慢病毒感染后72小时，效率低，细胞已经长满，有什么办法补救？
在慢病毒感染后72小时感染效率较低、细胞已经长满的情况下，可以尝试以下几个措施来提高感染效率并优化实验条件： 细胞传代或重新播种：如果细胞已经长满（汇合度较高），可能会影响慢病毒的感染效率。可以将细胞进行传代，重新播种在新的培养板上，使其达到较低的汇合度（例如30-50%），然后再进行感染。 优化感染时的MOI（Multiplicity of Infecti …
阅读更多 »Trizol法提取总RNA的流程
1.样品处理： 培养细胞：收获细胞1~5×107，加入1ml Trizol（异硫氰酸胍/酚）（在冰箱旁边取出白细胞即刻加入Trizol），混匀；用1ml注射器反复抽取（约30次）以破裂细胞及剪切DNA，室温静置5min（使核酸蛋白复合物完全分离）。 组织：取50~100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置5ml EP管中，加入1ml Trizo …
阅读更多 »测序胶的灌制、电泳及处理
推荐用6 ％丙烯酰胺、非梯度胶为起点。可使用两种胶：一种在相对短的时间获得较短的寡核苷酸信息；另一种是用较长时间以使较长的寡核苷酸得到最大限度的分离。这两种凝胶分离过程，采用6 ％丙烯酰胺，可以从一套测序反应中获得300~350 个碱基的序列信息。另一种可选的方案是使用两种不同浓度的胶，使较短片段和较长片段的寡核苷酸得到最大限度的分离。 材料 盛于喷射洗瓶的 …
阅读更多 »ChIP超详细实验步骤
ChIP的一般流程： 甲醛处理细胞—收集细胞，超声破碎—加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合—加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀—对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合—洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物—解交联，纯化富集的DNA-片断 …
阅读更多 »