1 电场参数 电场是电转染的重要因素,细胞在电场的作用下,膜通透性增加或是形成小孔,以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此,一个适宜的电场强度至关重要。 不同细胞系具有不同的最佳场强值,其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外,还可以 …
阅读更多 »细胞电转染实验的几点建议
1. 电场强度要合适 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞状态要好 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2 …
阅读更多 »细胞电转染实验的几点建议
1. 电场强度要合适 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞状态要好 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2 …
阅读更多 »细胞电转染实验效率不理想的原因
1. 不合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞选择错误 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期 …
阅读更多 »Hela细胞的电转染条件是什么?
使用Entranster-E电转液与指数衰减脉冲电转仪时Hela细胞的电转染条件是: 对于0.2 cm电转杯,细胞密度为3×10^6 cells/ml,DNA用量为2μg,电转液体积为100μl,电压为130V, 电容为950μF。 对于0.4 cm电转杯,细胞密度为3×10^6 cells/ml,DNA用量为5μg,电转液体积为250μ …
阅读更多 »电转染实验时,siRNA有什么要求?
使用Entranster-E试剂进行电转染实验时,要求使用纯度高、无菌且序列正确的siRNA。确定电转染的最佳siRNA浓度。尝试在250-750nM最终浓度范围内的siRNA浓度。Engreen建议导入一个非靶向或无意义的siRNA控制序列,以验证siRNA的基因特异性。此外,针对具有多个siRNA序列的基因可确保产生的表型不是由于脱靶效应所致 …
阅读更多 »Jurkat E6-1细胞的电转染条件是什么?
使用Entranster-E电转液与指数衰减脉冲电转仪时Jurkat E6-1细胞的电转染条件是: 对于0.2 cm电转杯,细胞密度为10×10^6 cells/ml,DNA用量为2μg,电转液体积为100μl,电压为150V, 电容为950μF。 对于0.4 cm电转杯,细胞密度为10×10^6 cells/ml,DNA用量为5μg,电 …
阅读更多 »电转染实验,如何设置正确的siRNA实验对照组?
1.设置空白对照组,检验细胞生长状态。 2.设置阴性对照组,无血清培养基 + Entranster-E 电转染试剂 + 阴性siRNA。 3.设置阳性对照组,无血清培养基 + Entranster-E 电转染试剂+ 靶向siRNA 转染管家基因,比如GAPDH 或者 Lamin A/C,之后通过western blotting 或者 mRNA quantif …
阅读更多 »电转感受态细胞的制备
1、 -80℃冰箱保存的菌种在SOB 固体平板上划单菌落; 2、次晨,挑选单克隆感至内含1ml SOB 液体培养基的试管中,37℃,300rpm,6 hr; 3、然后转接到含400ml SOB 液体培养基的2L 摇瓶中(按1:500 的量转接),300rpm,4hr,然后每隔2 min 测一次OD ,至OD =0.76; 4、立刻置冰水浴中骤冷,可以选择在一 …
阅读更多 »电转效率受哪些因素影响?
电穿孔效率受以下几种因素的影响: 外加电场的强度。电压过低,培养细胞质膜的改变不足以允许DNA 通过; 电压过高,细胞会受到不可逆的损伤。对于大多数哺乳动物细胞系, 电压250~ 500V/cm时可达到最高瞬时表达水平。通常经过电穿孔, 20% ~ 50%的细胞能够存活(根据台盼蓝拒染法的检测结果) ( Patterson 1979; Baum et al. …
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