细胞生物学

转染效率低的原因可从以下几方面找： 1.质粒DNA或混和液中含有血清。 对策：用无血清培养基或Opti-MEM培养基。 2.质粒DNA和转染试剂的比率不是最优 对策：对大多数细胞而言，质粒DNA和转染试剂的比例为1:2-1:3，一般要做优化实验，比例从1:0.5-1:5 逐一检测。 3.质粒DNA 已部分降解或质量不够好 对策：用好的质粒纯化试剂确保质粒DN …

1.设置空白对照组，检验细胞生长状态。 2.设置阴性对照组，无血清培养基 + Entranster-E 电转染试剂 + 阴性siRNA。 3.设置阳性对照组，无血清培养基 + Entranster-E 电转染试剂+ 靶向siRNA 转染管家基因，比如GAPDH 或者 Lamin A/C，之后通过western blotting 或者 mRNA quantif …

对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列 为了找到潜在靶位点，扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能，siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。 选择低GC含量的siRNA 纯化体外转录siRNA 在转染前要确认 …

由于心血管系统发病率、病死率高，严重威胁人类生命，随着心血管疾病研究的不断深入，以体外培养的血管平滑肌细胞作为研究模型，在心血管疾病，特别是在动脉粥样硬化研究中的应用越来越广泛。 （一）材料与设备 1. 设备超净工作台、离心机、水浴锅、CO2 培养箱、－70 ℃ 冰箱，－20 °C:冰箱。2. 无菌材料培养皿、止血钳、15ml 离心管、刻度吸管、弯头吸管、T …

Q9: 刚开始做实验，准备把RNAi的片段转入染色体内稳定表达，不知道是shRNA还是siRNA哪个比较好而且效率比较高？另外，一个载体里同时放两个针对不同基因的shRNA会不会相互影响？ A9: 稳定转染当然是shRNA。关于一个载体2个shRNA，涉及到2个shRNA的表达和加工的问题，关键还是2个shRNA都需要顺利表达的问题，这就和你的载体，以及2个 …

问：siRNA导入细胞有哪些方法，哪种最好？ 答：siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术是最为常用的方法，而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。 问：哪种转染试剂效果好？ …

可能原因： 1. RNA与转染试剂比例不佳。可进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳。 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。 3. RNA效率不高。选择最优RNA，并采用已知高效的RNA做对照。 4. RNA酶污染。建议无RNA酶和内毒素的吸头、离心管和溶液等材料和实验器具。 5. 转染后培养时间不够。在mRNA水平可以到48 小时以后验证结果，在蛋白水 …

下面以Entranster-H4000，DNA转染试剂为例，简要说明DNA细胞转染实验步骤 1.提前一天细胞铺板 提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞密度在60％左右为宜。 2.转染过程 ⑴将0.8μg的DNA用25μl无血清稀释液稀释，充分混匀，制成DNA稀释液。 注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。 ⑵将2μl的 …

体外培养的血管内皮细胞已广泛应用于血管疾病、血管修复、肿瘤血管形成等基础研究及临床研究中。体外培养的血管内皮细胞，仍可保持血管内皮细胞的特征，如表达VIII因子、怀布尔－帕拉德小体(Weibel-Palade body ) 、内皮细胞特异性抗原和IV 型胶原等，还可在三维培养体系或特定诱导条件下形成血管样结构。体外培养的血管内皮细胞生长形成单层后，会表现出接 …

瞬时转染后，划痕实验的最佳时间取决于几个因素，包括转染效率、基因表达时机以及细胞状态。一般来说，常见的策略如下： 1. 24 小时后划痕（常规选择） 绝大多数瞬时转染的基因在 24 小时左右开始有较高的表达水平，因此转染 24 小时后划痕是一个常见的选择。 这个时间点可以确保大部分细胞已成功表达外源基因，同时细胞仍然具有良好的活力，不会因过度表达导致过早凋亡 …