英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
下面把你给的条件先“翻译”成关键参数，方便对症下药：
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细胞：CHO-K1，约 1×10^7 cells/mL；
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杯子：0.4 cm 间隙；
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脉冲：方波，300 V，20 ms，1 次脉冲（相当于 750 V/cm）；
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DNA：20 μg 质粒；
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结果：存活率 95%，转染效率 30%；
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另外：细胞和电转杯在冰上，未回温到室温就电转。
一、效率偏低的主要可疑点（按“命中率”排序）
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温度过低
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低温会让膜更“硬”，需要更高场强才形成足够的孔；孔的开放时间也更短。
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这通常表现为“活得很好但进得少”（正符合你现在 95% 存活、30% 效率的现象）。
👉 建议：电转时细胞与杯子回到室温（20–25 °C）；脉冲后可在室温放 5–10 min 再 37 °C 复苏，或直接加预温培养基立即复苏（两种都可试对比）。
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场强/脉冲方案偏“温和”（对 CHO 来说）
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你现在是 750 V/cm × 20 ms × 1 脉冲。对很多哺乳细胞，1000–1500 V/cm 往往更高效；
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多脉冲（2–3 次）或稍短脉冲（5–10 ms）+ 多次，常比单个 20 ms 更有效，且对活率影响不大。
👉 建议做一个小型矩阵：-
电压（0.4 cm 杯）：400、500、600 V（=1000、1250、1500 V/cm）；
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脉宽：5 ms 与 10 ms；
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脉冲数：2 脉冲（间隔 100 ms）对比 1 脉冲。
这样 3×2×2 共 12 条件，小体量就能找出甜点区。
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细胞密度偏高造成“屏蔽效应”
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1×10^7/mL 在某些体系里会降低单位细胞受场强；适度降低可提升效率。
👉 建议：每杯 2–5×10^6 个细胞（按 100 μL 体积计即 2–5×10^7/mL；若你做 250 μL/杯，则总数控制在 5–10×10^6 个/杯 更稳妥）。关键是“每杯总细胞数”而非仅仅“浓度”，注意保持总体积 80–200 μL 之间更易控。
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缓冲液电导过高
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含盐（PBS、培养基、血清）的体系电导大、发热、实际场强不足，效率会掉。
👉 建议：-
采用Entranster-E电转液；
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电转前两次离心换缓冲；
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避免血清、Ca^2+/Mg^2+；消泡、避免气泡。
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DNA 用量与质量
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20 μg/杯通常偏多，效率未必更高，反而增加离子/粘度/发热问题；
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确保无内毒素、超螺旋比例高。
👉 建议：3–10 μg/杯 做梯度（3、6、10 μg），保持浓缩、体积极小（≤10% 总体积），并与细胞充分混匀。
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细胞状态
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寻找对数生长期、>95% 活率、近期未过度胰酶化、无抗生素压力；
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电转后立即补加预温完全培养基，静置恢复（不摇晃、不离心）4–6 h 再换液。
二、关于“冰浴未回温”是否导致效率低？
很可能是主要原因之一。
低温让膜流动性下降、阈值电压上升，导致在相同电压下孔形成不足；同时低温细胞代谢慢，质粒内吞/核进口过程也更慢。这与“高存活、低效率”的现象一致。
因此，把杯子和细胞回到室温再打脉冲，通常能明显提升效率（同时关注不要因为温度上升而出现打火——这就需要低电导缓冲与去泡）。
三、一步到位的优化方案（可直接照做）
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准备
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细胞对数期、无抗生素；
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两次 PBS（无 Ca/Mg）快速洗→换Entranster-E电转液；
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计数后每杯5–8×10^6 个细胞，总体积 100–150 μL；
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杯子与细胞回到室温；质粒6 μg/杯起步（无内毒素，超螺旋）。
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脉冲设置（方波，0.4 cm）
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500 V，10 ms，2 脉冲，间隔 100 ms（首选条件）；
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若效率仍低：试 600 V，5–10 ms，2 脉冲；
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若活率明显下降：退回 400–500 V，5–10 ms，2 脉冲 或 500 V，5 ms，3 脉冲。
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记录实际电流/能量读数，避免异常发热或打火。
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脉冲后处理
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杯中静置 5 min（室温）→ 缓慢加入 37 °C 预温完全培养基到 0.5–1 mL → 温和转移到孔板；
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4–6 h 后轻换液；
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24–48 h 检测表达。
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对照与微调
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温度对照：室温 vs 冰上（你会直观看到差异）；
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DNA 梯度：3、6、10 μg；
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四、常见小坑提醒
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杯内气泡是打火与失败的头号元凶；
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杯壁残留液珠会改变等效间隙；
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细胞团聚会显著降效，必要时可轻微过滤（40 μm 滤网）；
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过厚或超大质粒往往更难进，尽量选中小型、强启动子、核定位优化的构建；
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若做稳定系，电转后 24 h 再加药筛选，别立即上药。
结论：
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你现在的低效率，“冰浴未回温就电转”非常可能是关键原因；
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同时把场强适度上调、改成多脉冲短脉宽、降低细胞总数与DNA用量、使用Entranster-E电转液并室温操作，通常能把 CHO-K1 的瞬时转染效率推到 60–90% 区间（具体取决于质粒与读出方式）。